本文選自cell proliferation??DOI: 10.1111/cpr.12816饶火，喜歡的朋友可以自行下載
啥也不說抄瓦，上圖济竹。
本文所選擇Pin1是基于作者先前的實驗基礎(chǔ)伟恶，Pin1通過c-Myc/NRF2軸維持氧化還原平衡，在支持胰腺癌生長中發(fā)揮致癌作用哼鬓，并強調(diào)它是PDAC的一個獨立的預(yù)后標(biāo)志物,應(yīng)用RNA測序技術(shù)檢測野生型(WT)細(xì)胞监右、空載體(EV)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和Pin1過表達(dá)的MIAPaca-2細(xì)胞的基因表達(dá)譜，以探索潛在的靶點魄宏。然后秸侣，根據(jù)GSEA中的數(shù)據(jù)集分析不同的組存筏。在所有特征中宠互，“TNFA_Signal_Via_NFKB”和“IL6_JAK_STAT3_SIGALING”在Pin1過表達(dá)組和EV/WT組之間顯示出最高的歸一化富集評分,此外，高表達(dá)的基因顯然與改變的信號通路有明確的聯(lián)系.
作者進(jìn)一步將兩組間比較的重點聚集在NF-RB通路上椭坚，對比了兩個比較足組之間的在NF-RB通路上差異表達(dá)的基因予跌。觀察到兩個熱圖中的幾個相互作用的基因，包括IL-18善茎、TNF券册、TNFAIP3等，表明它們可能強烈參與PIN1高表達(dá)相關(guān)的NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。（也就是兩者取了個交集）
為了驗證發(fā)現(xiàn)烁焙，根據(jù)之前關(guān)于Pin1在PDAC中的作用的研究航邢，另外穩(wěn)定地將Pin1特異性shRNA轉(zhuǎn)染Capan-1和SW1990細(xì)胞。qPCR結(jié)果顯示骄蝇，在Pin1過表達(dá)的MIAPaca-2細(xì)胞中IL-18的mRNA水平升高膳殷，而在Pin1基因敲除的Capan-1和SW1990細(xì)胞中IL-18mRNA的表達(dá)水平降低。此外九火，Pin1過表達(dá)的MIACapa-2細(xì)胞株IL-18蛋白表達(dá)上調(diào)赚窃，而Pin1基因敲除的Capan-1和SW1990細(xì)胞IL-18表達(dá)顯著降低，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-18的分泌水平也顯著降低岔激。因此勒极，PIN1在胰腺癌細(xì)胞中可能激活NF-κB信號，并與IL-18的表達(dá)相關(guān)虑鼎。
然后辱匿，作者又進(jìn)一步在組織水平驗證了Pin1與IL18的表達(dá)以及預(yù)后的關(guān)系，確定了其臨床意義炫彩。
然后作者又作了一波Pin1和IL18的功能學(xué)實驗掀鹅。也可能作者以前實驗做過Pin的功能學(xué)實驗，所以這里他做的是Pin1和IL18的分組較少媒楼。中心思想就是Pin1調(diào)控了IL18乐尊，顯示出在侵襲、增殖方面的功能划址。文中rescue實驗用了重組人白細(xì)胞介素18rhIL18.
既然驗證了表型扔嵌，那么Pin1是否通過NF-rB通路調(diào)控了IL18的表達(dá)呢，作者進(jìn)一步驗證了Pin1在調(diào)控NF-RB中的作用夺颤，PIN1在一些癌細(xì)胞中被鑒定為P65的正調(diào)控因子痢缎。為了確定PIN1-P65在胰腺癌細(xì)胞中是否發(fā)生相互作用，進(jìn)行了內(nèi)源性CoIP世澜。結(jié)果表明独旷，在CAPAN-1和SW1990細(xì)胞中，內(nèi)源性Pin1與p65相互作用寥裂。P65的磷酸化也因Pin1的差異表達(dá)而改變嵌洼。p65和p-p65的核表達(dá)也被Pin1的表達(dá)顯著改變，而p65的總體細(xì)胞表達(dá)沒有變化封恰，這表明Pin1在p65易位和磷酸化后的轉(zhuǎn)錄活性中發(fā)揮了作用麻养，免疫熒光分析也證實了Pin1的過表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞質(zhì)p65的移位到MIA Paca-2細(xì)胞的細(xì)胞核中，接下來诺舔，我們評估了PIN1對NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響鳖昌，這是通過NF-κB-熒光素酶實驗證明的备畦。雙熒光素酶分析顯示，在CAPAN-1和SW1990細(xì)胞中许昨，PIN1的表達(dá)以劑量依賴的方式增加了NF-κB的活性懂盐。
小朋友，是不是有很多問號糕档，別急允粤，我來解決你的疑惑，上梁子翼岁。這個NF-RB有可能就是破解炎癌轉(zhuǎn)換過程的樞紐（我就把這1個億的項目撂這了类垫，拿不拿你自己看著辦吧），小伙伴們琅坡，有相關(guān)領(lǐng)域的趕緊操練起來啊悉患。NF-kB家族有5個成員，包括NF-kB1（p50）榆俺、NF-kB2（p52）售躁、RelA（p65）、RelB和c-Rel茴晋，通常所說的NF-kB蛋白陪捷，是指p65/p50亞單位形成的NF-KB1二聚體蛋白；RelB/p52亞單位形成NF-kB2二聚體蛋白诺擅，研究發(fā)現(xiàn)市袖，激活NF-kB的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有以下三種:經(jīng)典通路、旁路通路和非典型通路烁涌。NF-kB1苍碟，RelA，c-Rel撮执，均由經(jīng)典通路激活微峰，而NF-kB2，RelB抒钱，由旁路通路激活蜓肆，此外還有DNA氧化損傷等誘導(dǎo)的非典型通路；p65的翻譯后修飾谋币，也調(diào)節(jié)NF-kB通路活性（這么看來作者的研究基本都是基于已知結(jié)果的研究）關(guān)于這個通路仗扬，喜歡的可以自己閱讀以下https://baike.baidu.com/item/NF-kB%E4%BF%A1%E5%8F%B7%E9%80%9A%E8%B7%AF/7060376?fr=aladdin
但是這個P65和IL18有什么關(guān)系呢，再者說IL18怎么又構(gòu)成了loop了呢瑞信？且聽作者緩緩道來厉颤。為了了解p65在IL-18表達(dá)中的作用，建立了穩(wěn)定的p65基因敲除的CAPAN-1和SW1990細(xì)胞系凡简。穩(wěn)定的p65基因敲除導(dǎo)致IL-18蛋白表達(dá)降低逼友。經(jīng)腫瘤壞死因子α處理4h后，p65誘導(dǎo)的IL-18mRNA水平升高秤涩，但p65基因敲除細(xì)胞系的這種影響明顯減輕帜乞，TCGA-PAAD隊列的數(shù)據(jù)驗證了p65和IL-18之間的相關(guān)性。
此外筐眷，GSEA分析發(fā)現(xiàn)黎烈，高IL-18表達(dá)相關(guān)信號“TNFA_Signal_Via_NFKB”表現(xiàn)出最高的NES，P<0.001(圖5e)匀谣，這表明高IL-18與NF-κB途徑的升高密切相關(guān)照棋。隨后的Westernblot分析表明，rhIL-18刺激CAPAN-1和SW1990細(xì)胞增加了細(xì)胞核p65的表達(dá)武翎，雙熒光素酶分析表明烈炭，在CAPAN-1和SW1990細(xì)胞中，IL-18的表達(dá)以劑量依賴的方式增加了NF-κB的活性宝恶，在IL-18啟動子中符隙，存在一個保守的p65結(jié)合元件，該元件與一個相對不保守的元件相鄰垫毙。因此霹疫，我們設(shè)計了覆蓋這兩個結(jié)合位點的引物，并進(jìn)行了CHIP综芥，以探索P65是否可以占據(jù)其中一個結(jié)合位點丽蝎。芯片結(jié)果顯示P65可以與該區(qū)域相互作用，進(jìn)一步的芯片分析表明P65可以占據(jù)兩個結(jié)合元件中的任何一個膀藐。
這里作者的反饋環(huán)路就構(gòu)建完成了征峦，但是如何證明Pin1是通過NF-RB途徑調(diào)節(jié)IL18的呢？作者用TNF-a誘導(dǎo)IL18表達(dá)消请，然后在敲減了Pin1的細(xì)胞中用TNF-a不能誘導(dǎo)IL18表達(dá)栏笆，在蛋白質(zhì)和RNA水平雙重驗證。這里他們用的是上清中的IL18,因為IL18是分泌蛋白臊泰，所以細(xì)胞中的水平不一定會高蛉加，如果做分泌蛋白的同學(xué)，一定要注意了缸逃，要不然可能跑不出想要結(jié)果针饥。
將IL-18啟動子區(qū)克隆到熒光素酶載體上，然后與Pin1表達(dá)載體和/或p65表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染需频。雙熒光素酶分析顯示Pin1以劑量依賴方式增強IL-18啟動子活性丁眼。當(dāng)轉(zhuǎn)染Pin1和P65比只轉(zhuǎn)染Pin1時IL18啟動子活性更高，結(jié)果提示Pin 1可能激活p65在IL-18啟動子上的轉(zhuǎn)錄活性昭殉，為了發(fā)現(xiàn)Pin1和p65與IL-18啟動子區(qū)染色質(zhì)的相互作用苞七，我們發(fā)現(xiàn)Pin1基因敲除組IL-18啟動子上p65的占有率降低藐守，提示Pin1通過p65活性影響IL-18轉(zhuǎn)錄，Pin1和P65在CAPAN-1和SW1990細(xì)胞系中主要共定位蹂风，因此卢厂，我們推測Pin1和P65可能與IL-18啟動子相互作用。CHIP結(jié)果顯示惠啄，Pin1也可以占據(jù)p65能夠結(jié)合的兩個結(jié)合元件中的任何一個慎恒。重新CHIP顯示Pin1和p65占據(jù)了IL-18啟動子的相同區(qū)域。隨后的熒光素酶檢測表明撵渡，當(dāng)兩個結(jié)合側(cè)的任何一個序列發(fā)生突變時融柬，Pin1和p65對突變的熒光素酶報告基因的積極影響降低。當(dāng)兩個序列都發(fā)生突變時趋距，正效應(yīng)完全喪失粒氧。
至此，本文結(jié)束棚品，挺好的一篇文章靠欢，雖然發(fā)的是5分的雜志，主要還是創(chuàng)新性不足铜跑，但是我覺得再動物上在捯飭捯飭肯定可以發(fā)個更高的點數(shù)门怪，這篇文章結(jié)構(gòu)緊湊，邏輯嚴(yán)謹(jǐn)锅纺，適合學(xué)習(xí)掷空，文章還提到另外一個通路，還沒有頭緒的同學(xué)可以試試囤锉。歡迎批評坦弟、指正。
