空間組學(xué)揭示肝臟巨噬細(xì)胞微環(huán)境的進(jìn)化保守性與差異

Highlights

健康和肥胖小鼠和人肝臟的空間組學(xué)單細(xì)胞圖譜

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡驗(yàn)證

LAM在正常和脂肪肝中的位置不同

進(jìn)化保守的BMP9/10-ALK1軸對(duì)KC的發(fā)生至關(guān)重要

In Brief

通過將單細(xì)胞和核測(cè)序與 RNA 和蛋白質(zhì)的空間圖譜相結(jié)合雷滋，這個(gè)龐大的健康和肥胖人類和小鼠肝臟空間蛋白質(zhì)組圖譜提供了識(shí)別和定位所有肝細(xì)胞的方法彻犁，并提供了對(duì)肝髓系細(xì)胞的見解，包括識(shí)別可靠的表面標(biāo)志物用于肝巨噬細(xì)胞的分離和定位，健康和脂肪肝中脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞的表征嗡贺，Kupffer 細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控軸的測(cè)定，以及7個(gè)物種（包括雞和斑馬魚）的 Kupffer 細(xì)胞保守核心基因表達(dá)特征的鑒定。

SUMMARY

肝臟是人體最大的實(shí)體器官劫扒，但其特征仍然不完整。在這里狸膏，我們提出了一個(gè)健康和肥胖的人類和小鼠肝臟的空間蛋白質(zhì)組圖譜沟饥，該圖集結(jié)合了單細(xì)胞 CITEseq、單核測(cè)序湾戳、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和空間蛋白質(zhì)組學(xué)贤旷。通過整合這些多組數(shù)據(jù)集，我們提供了經(jīng)過驗(yàn)證的策略來(lái)可靠地區(qū)分和定位所有肝細(xì)胞砾脑，包括膽管中的脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞 (LAM) 群幼驶。然后，我們將這個(gè)圖譜在七個(gè)物種中進(jìn)行比對(duì)韧衣，揭示真正的Kupffer細(xì)胞和 LAM 的保守程序盅藻。我們還揭示了這些巨噬細(xì)胞各自的空間分辨細(xì)胞生態(tài)位和驅(qū)動(dòng)其獨(dú)特轉(zhuǎn)錄組特性的微環(huán)境回路。我們證明 LAM 是由局部脂質(zhì)暴露誘導(dǎo)的汹族，導(dǎo)致它們?cè)谛∈蠛腿祟惛闻K的脂肪變性區(qū)域中被誘導(dǎo)，而Kupffer細(xì)胞的發(fā)育關(guān)鍵取決于它們通過進(jìn)化上保守的 ALK1-BMP9/10 軸與肝星狀細(xì)胞的相互作用夸政。

INTRODUCTION

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的巨大進(jìn)步使人們能夠更好地了解跨物種不同器官的細(xì)胞組成榴徐。然而守问，我們?nèi)匀蝗狈﹃P(guān)于這些細(xì)胞如何在其獨(dú)特的微環(huán)境生態(tài)位中組織的信息。此外坑资，決定了組織中單個(gè)細(xì)胞的身份的特定的細(xì)胞間相互作用還需要被定義耗帕。雖然了解肝臟內(nèi)肝細(xì)胞的空間組織，但非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞的空間組織仍不清楚袱贮。小鼠肝臟就是這種情況仿便，但人類肝臟更是如此，因?yàn)榇蠖鄶?shù)肝細(xì)胞的鑒定和精確定位是未知的攒巍。此外嗽仪，尚未研究轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組之間的聯(lián)系，導(dǎo)致缺乏可靠的表面標(biāo)志物來(lái)通過流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡識(shí)別這些細(xì)胞柒莉。在這里闻坚，我們使用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，包括通過測(cè)序?qū)D(zhuǎn)錄體和表位進(jìn)行細(xì)胞索引(cite-seq)和空間方法來(lái)確定所有細(xì)胞及其在健康和肥胖小鼠和人類肝臟中的特定位置兢孝，以識(shí)別小鼠和人類健康和肥胖肝臟中的所有細(xì)胞及其特定位置窿凤。通過這樣做仅偎，我們制定了識(shí)別和進(jìn)一步研究肝細(xì)胞的策略。為了證明這種方法的有用性雳殊，我們確定了驅(qū)動(dòng)不同肝巨噬細(xì)胞表型的進(jìn)化保守和空間受限信號(hào)橘沥。

RESULTS

小鼠肝臟蛋白質(zhì)組圖譜

使用小鼠肝臟，我們比較了使用通過離體或體內(nèi)酶消化分離的細(xì)胞的單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNAseq) 與單核 RNA 測(cè)序 (snRNA-seq)（圖 S1A-S1C）相种。我們沒有觀察到兩種消化方法之間基因/細(xì)胞數(shù)量的任何差異（圖 S1D 和 S1E）威恼，但 snRNA-seq 通常產(chǎn)生較少數(shù)量的基因/細(xì)胞（圖 S1D 和S1F）。這并沒有阻止在 snRNA-seq 數(shù)據(jù)集中識(shí)別出不同的細(xì)胞類型寝并，因?yàn)?scRNA-seq 和snRNA-seq 在每個(gè)群體中都識(shí)別出高表達(dá)的基因。然而斤蔓，scRNA-seq 中的表達(dá)通常更高（圖 S1F）弦牡。

(A-C) UMAPs 顯示細(xì)胞類型的注釋和每種細(xì)胞類型的比例驾锰，作為使用(A) 離體消化分離的 UMAP 中總細(xì)胞的百分比椭豫； 13,144 個(gè)細(xì)胞赏酥，(B) 體內(nèi)消化； 24,014 個(gè)細(xì)胞和 (C) 細(xì)胞核呵晨； 8,583 個(gè)核何荚。

(D) 每種分離方法后帶注釋的 mac、B 細(xì)胞皂吮、肝細(xì)胞蜂筹、內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞群中基因/細(xì)胞的平均數(shù)量艺挪。

(E) 相關(guān)圖顯示當(dāng)肝臟在體外與體內(nèi)消化方案消化時(shí)在 mac 群體中捕獲的基因口蝠。

(F) 相關(guān)圖顯示當(dāng)使用體內(nèi)消化方案分離細(xì)胞或分離細(xì)胞核時(shí)在mac妙蔗、內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞群中捕獲的基因眉反。

為了研究單細(xì)胞分辨率下的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)，我們使用了 CITE-seq梳杏，蛋白質(zhì)和 mRNA 譜都被考慮用于聚類秘狞。對(duì)差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)（DEG/DEP烁试；圖S2A 和 S2B；表 S1）的分析確定了 17 種細(xì)胞類型（圖 1B）支示，它們?cè)诿糠N分離方法中都有不同的表現(xiàn)（圖 S2C）颂鸿。在 CITE-seq 分析中添加抗體可以識(shí)別所有細(xì)胞的表面標(biāo)記嘴纺，包括 Kupffer 細(xì)胞(KC) 的 VSIG4 和 FOLR2尖坤，而不會(huì)影響轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的質(zhì)量（圖 2D）慢味。該分析確定了 KC 的一個(gè)亞群纯路。

肝髓細(xì)胞亞群的不同空間方向

為了定位識(shí)別出的細(xì)胞感昼，我們使用 Visium 進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析定嗓。為此宵溅，我們從兩個(gè)不同的方向切開肝臟，以描繪肝組織和包膜的輪廓（圖 1C 和 S2K）藕施。我們沿著空間軌跡對(duì)每個(gè) Visium 點(diǎn)進(jìn)行排序矛市，并根據(jù)已知的肝細(xì)胞分區(qū)標(biāo)記對(duì)門靜脈浊吏、門靜脈周圍找田、中間和中央靜脈區(qū)域進(jìn)行注釋，并使用共聚焦顯微鏡確認(rèn)此注釋（圖 S2M）。通過使用參考 sc/snRNA-seq 數(shù)據(jù)植袍，我們隨后將每個(gè)點(diǎn)解卷積為其組成細(xì)胞類型氛魁，并研究了細(xì)胞豐度如何隨分區(qū)而變化（圖1F捶码、1G 和 S2N）惫恼。雖然 KC 位置是分區(qū)的祈纯，但我們沒有在 KC 的基因表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈的分區(qū)模式。我們進(jìn)一步鑒定了所有區(qū)域的 B 細(xì)胞簇爆、T 細(xì)胞入蛆、內(nèi)皮細(xì)胞 (EC) 和基質(zhì)細(xì)胞 (SC)，而在門靜脈 (PV) 中發(fā)現(xiàn)了常規(guī)樹突細(xì)胞 (cDC)挑庶，其在中央靜脈中少量存在(圖 1F迎捺、1G 和 S2N)凳枝。

為了在單細(xì)胞分辨率下驗(yàn)證這些位置叛买，我們接下來(lái)試圖確定也可以通過共聚焦顯微鏡工作的最佳細(xì)胞特異性表面標(biāo)記。為了同時(shí)篩選多種抗體以識(shí)別那些通過顯微鏡工作的抗體露戒，我們進(jìn)行了第二次Visium分析动漾，并補(bǔ)充了100種寡偶聯(lián)抗體旱眯，這些抗體是根據(jù)CITE-seq結(jié)果選擇的(圖1H)。然后吼鳞，使用MICS技術(shù)和60-plex抗體組赔桌，在單細(xì)胞分辨率下驗(yàn)證被確定為在空間上起作用的抗體(圖1I)。使用Xcr1惨奕、Clec9a (cDC1s)和Cd209a雹洗、Mgl2和Clec10a (cDC2s)的表達(dá)，我們證實(shí)cDC1s和cDC2s主要位于門靜脈(圖1J)螃成。由于cDC2s與單核細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞有許多共同的基因(圖S2A)宁炫，我們也檢測(cè)了普通單核細(xì)胞/mac (Cd14羔巢、Adgre1、Axl、Mafb常摧、Cx3cr1和C5ar1)和KC特異性基因(Cd5l和Vsig4)的表達(dá)落午，以進(jìn)一步驗(yàn)證它們是真正的cDC2s(圖1J)。在這些分析中肚豺，mRNA表達(dá)的點(diǎn)狀性質(zhì)與髓樣細(xì)胞的樹突形狀相結(jié)合溃斋，使得難以確定細(xì)胞邊界并得出這些cDC2s和macs是不同細(xì)胞的結(jié)論。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)吸申，我們因此開發(fā)了一種結(jié)合mRNA檢測(cè)(RNAScope)和表面蛋白檢測(cè)的方案梗劫。結(jié)合蛋白表面標(biāo)記物檢查cDC-或MAC-特異性mRNAs的表達(dá)證實(shí)了PV

cDC1、cDC2s和非KC macs的存在(圖1K)截碴。

總之日丹，通過結(jié)合多種空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法晒旅，我們定位了小鼠肝臟中的所有細(xì)胞，并鑒定了髓系細(xì)胞中的其他異質(zhì)性蚓哩，這些異質(zhì)性在單獨(dú)檢查sc/sn-RNAseq數(shù)據(jù)集時(shí)沒有顯示出來(lái)曹阔。這突出了結(jié)合單細(xì)胞和空間蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來(lái)研究細(xì)胞異質(zhì)性的力量纠永。

(A)? ?通過離體（5 只小鼠，15個(gè)樣品）或體內(nèi)（5 只小鼠，19 個(gè)樣品）酶消化從健康的 C57B/l6 小鼠中分離肝細(xì)胞侨歉』鹇觯或者，通過組織勻漿分離細(xì)胞核（4 只小鼠，12個(gè)樣品）”考Γ活細(xì)胞/完整細(xì)胞核經(jīng)過 FACS 純化。對(duì)于細(xì)胞送滞，分選總活細(xì)胞功蜓、活 CD45+扰楼、活 CD45+腾节、活肝細(xì)胞或骨髓細(xì)胞（活 CD45+、CD3+晦嵌、CD19+棒妨、B220+、NK1.1+）。 18 個(gè)樣品（7 個(gè)離體剖笙，1 1 個(gè)體內(nèi)）也用一組 107-161 個(gè)條形碼標(biāo)記的抗體染色脆诉，用于 CITE-seq 分析。將所有數(shù)據(jù)集匯集在一起藕夫，并在 QC 后使用 TotalVI 對(duì) 185,894 個(gè)細(xì)胞/細(xì)胞核進(jìn)行聚類誉尖。 (B) sc/snRNA-seq 數(shù)據(jù)的UMAP琢感。 (C) 來(lái)自 Visium 分析的組織和包膜圖像柬甥，其中覆蓋了簇窟扑。 (D) Visium 斑點(diǎn) (左) 和細(xì)胞起源 (右) 的分區(qū) UMAP墙懂。 (E) 映射到組織切片上的分區(qū)模式剩瓶。 （F 和 G）來(lái)自 sc/snRNA-seq 的指示細(xì)胞特征映射到 Visium 分區(qū)數(shù)據(jù)。(H) Visium 高度多重蛋白質(zhì)分析中的 mRNA 分區(qū)模式和 VSIG4-ADT 表達(dá)模式（左）和指定抗體的分區(qū)表達(dá)模式（右）城丧。 (I) 指定蛋白質(zhì)的MICS 分析延曙。 (J) 指定基因和細(xì)胞類型的分子制圖。 (K) 同一組織切片中的 mRNA (Xcr1亡哄、Flt3l枝缔、Mafb 和 Clec10a) 和蛋白質(zhì) (MHCII 和F4/80) 表達(dá)。比例尺蚊惯，50 毫米魂仍。 PV拐辽，門靜脈； CV擦酌，中央靜脈俱诸。箭頭表示特定的細(xì)胞類型，顏色對(duì)應(yīng)于細(xì)胞類型/標(biāo)記赊舶。圖像代表 2-4 只小鼠睁搭。

髓系細(xì)胞的精細(xì)分析確定了肝巨噬細(xì)胞的三個(gè)亞群

為了更好地理解非kc mac細(xì)胞，我們?cè)趕c/snRNA-seq分析中放大了髓系細(xì)胞(CDC笼平、KCs园骆、單核細(xì)胞和單核細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞)，定義了11個(gè)群體(圖2A-2C寓调；表S2)锌唾。這包括KC、3組非KC MACs夺英，以及在單核細(xì)胞和巡視單核細(xì)胞(MACs)之間的細(xì)胞晌涕，稱為過渡性單核細(xì)胞。仔細(xì)檢查非KC mac痛悯，發(fā)現(xiàn)群集6為腹膜mac(圖2B)余黎。其余人群之間的degs表明，cluster7很可能類似于包膜MACs载萌，表達(dá)Cd207和CX3CR1惧财，而cluster8類似于我們最近在脂肪肝中描述的GPNMB+SPP1+脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞(LAMs)(圖2A-2D)。通過CITEseq數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證上述分群扭仁。盡管分子制圖證實(shí)了囊膜中存在Cd207+Mac垮衷，但它也在CV處發(fā)現(xiàn)了Cd207+Mac，這在PV中很少發(fā)現(xiàn)(圖2E-2H和S3G-S3J)乖坠。因此搀突，簇7由囊膜和CV CD207+MACs組成。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明了用空間方法來(lái)確認(rèn)細(xì)胞身份的必要性瓤帚。分子圖還發(fā)現(xiàn)描姚，靜脈和血管上的巨噬細(xì)胞表達(dá)CCR2和Chil3(圖2G涩赢、2H戈次、S3H和S3J)，類似于過渡單核細(xì)胞(群集11)筒扒。最后怯邪，在膽管周圍發(fā)現(xiàn)大量表達(dá)MACs的GpNMB(圖2G、2H花墩、S3H悬秉、S3K和S3L)澄步。由于GPNMB的表達(dá)是簇8特異性的(圖2B)，并且這些細(xì)胞類似于LAM和泌，我們將這些細(xì)胞命名為膽管LAM村缸。

KCs和LAMs在穩(wěn)態(tài)鼠肝中功能不同

接下來(lái)，我們?cè)噲D調(diào)查KCs和LAM之間的差異武氓。對(duì)與這些細(xì)胞的生物過程相關(guān)的GO術(shù)語(yǔ)的分析表明梯皿，KC可能在調(diào)節(jié)體液反應(yīng)中發(fā)揮作用，而LAM與免疫反應(yīng)的關(guān)系更廣泛（圖2I和2J）县恕。與此一致东羹，在100倍蛋白質(zhì)顯微鏡數(shù)據(jù)中，我們注意到忠烛，存在的B細(xì)胞中有很大一部分與KC相互作用属提，而T細(xì)胞沒有觀察到這一點(diǎn)（圖2K）。這表明這兩個(gè)群體之間存在相互作用美尸，可能與小鼠KCs高表達(dá)B細(xì)胞趨化因子Cxcl13有關(guān)（表S2）冤议。為了評(píng)估LAMs與KC的炎癥性質(zhì)，我們采用FACS純化細(xì)胞火惊，并進(jìn)行qPCR分析求类，以檢測(cè)各種細(xì)胞因子的表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn)LAM純化屹耐，我們?cè)谙M織之前去除了包膜尸疆。與GO分析相吻合，LAMs在穩(wěn)態(tài)下比KCs表達(dá)更多Il1b（圖2L）惶岭。然而寿弱，盡管如此，在體內(nèi)TLR4刺激下按灶，它們?cè)诖傺缀涂寡准?xì)胞因子方面的反應(yīng)不如KC（圖2L）症革，這可能表明LPS耐受性。這可能是因?yàn)樗鼈兾挥赑V處鸯旁，因此暴露于腸道血液中噪矛，盡管這仍有待測(cè)試。綜上所述铺罢，這突出了這些細(xì)胞的獨(dú)特性質(zhì)和功能艇挨；然而，需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定這些細(xì)胞的確切作用韭赘。

圖2.健康小鼠肝臟膽管周圍的巨噬細(xì)胞群

(A)從圖1B分離的小鼠髓系細(xì)胞的UMAP(71,261個(gè)細(xì)胞/核)缩滨，并與TotalVI重新聚類。

(B和C)細(xì)胞類型間的TOP DEGS(B)和DEPS(C)。

(D)GPNMB和Cd207的表達(dá)脉漏。

(E)共聚焦顯微鏡下VSIG4和F4/80(左)(小鼠巨噬細(xì)胞標(biāo)志物)或MHCII苞冯、CD11c和DAPI(右)的表達(dá)。由白色箭頭標(biāo)識(shí)的包膜MAC侧巨。比例尺舅锄，50毫米。

(F)肝被膜指示基因的分子圖譜司忱。

(G)共聚焦顯微鏡下VSIG4巧娱、F4/80、GLUL和DAPI(左)或F4/80或CCR2(右烘贴，插圖)的表達(dá)禁添。比例尺，100毫米桨踪。

(H)門脈三聯(lián)體指示基因的分子圖譜老翘。PV，門靜脈锻离；CV铺峭，中央靜脈；HA汽纠，肝動(dòng)脈卫键；BD，膽管虱朵。箭頭表示特定的單元格類型莉炉，其中顏色對(duì)應(yīng)于標(biāo)記。圖像代表2-4只老鼠。

(i和j)KCS(I)和膽管LAM(J)的Top Go術(shù)語(yǔ)。

(K)MICS分析顯示VSIG4(紅色)含末、CD19(黃色)和CD3E(洋紅)表達(dá)的代表性圖像(左)和每視野發(fā)現(xiàn)的有/無(wú)KC的B或T細(xì)胞的百分比(右)。數(shù)據(jù)來(lái)自2只小鼠的多個(gè)視野绍昂。*p<0.001 t檢驗(yàn)。

(L)給29周齡小鼠腹腔注射LPS或PBS 3.5 mg/kg偿荷，2h后無(wú)包膜取肝窘游。用流式細(xì)胞儀(FACS)純化KCS和LAM，用qPCR檢測(cè)IL1b跳纳、TNF忍饰、IL10和IL18的表達(dá)，并與b-actin進(jìn)行比較棒旗。

巨噬細(xì)胞亞群存在于不同的空間生態(tài)位中

由于所有mac群在局部環(huán)境中都與CD45-關(guān)系密切喘批，我們進(jìn)一步分析了 CD45-細(xì)胞，識(shí)別 ECs 和 SCs 的多個(gè)子集以及區(qū)分它們的門控策略（圖 3A-3C 和 S4A-S4C铣揉；表 S3）饶深。 EC 可以進(jìn)一步細(xì)分為 4 個(gè)不同的集群，對(duì)其位置的分析可以將它們識(shí)別為 CV EC（集群 10）逛拱、LSEC（聚類9）敌厘、PV內(nèi)皮細(xì)胞（聚類11）和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（LEC；聚類12）（圖3D朽合、3E俱两、S4D和S4E）。由于Visium在PVs和CVs中都發(fā)現(xiàn)了成纖維細(xì)胞（圖3D）曹步，并且之前的一份報(bào)告表明這些細(xì)胞中存在不同的亞群（Dobie et al.宪彩，2019），我們進(jìn)一步放大了SCs讲婚，以更好地評(píng)估其異質(zhì)性（圖3F尿孔、3G、S4A–S4C和S4F筹麸；表S4）活合。這表明間皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的亞群僅限于b（圖3H和3I）。Myh11+血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）位于肝動(dòng)脈物赶、PVs和包膜白指，CVs周圍（圖3F-3H、3J和S4G）和Mfap4+Svep1+Clic5-Reln-成纖維細(xì)胞為CV成纖維細(xì)胞（圖3G酵紫、3H告嘲、3J和S4G）。最后奖地，我們確定了位于膽管細(xì)胞周圍的Clic5+Reln+成纖維細(xì)胞（cluster3）的一個(gè)子集状蜗，我們稱之為膽管成纖維細(xì)胞（圖3J和S4G）。綜上所述鹉动，這些在空間上不同的ECs和SCs亞群的存在突出了不同mac群體所處的特定微環(huán)境的獨(dú)特性轧坎。

圖3.肝巨噬細(xì)胞群居于不同的微環(huán)境

(A) 小鼠CD45-的UMAP圖。從圖1B分離的細(xì)胞(83,410個(gè)細(xì)胞/核)泽示，與TotalVI重新聚集缸血。

(B和C)細(xì)胞類型間的TOP DEGS(B)和DEPS(C)

(D)將來(lái)自sc/snRNA-seq的指示細(xì)胞標(biāo)志映射到Visium分帶數(shù)據(jù)。

(E)中央靜脈(左)和兩個(gè)不同的門靜脈三聯(lián)體(中和右)的指示基因的分子制圖械筛。

(F)從圖3A中的UMAP分離的小鼠基質(zhì)細(xì)胞的UMAP(5430個(gè)細(xì)胞/核)捎泻，并與scVI重新聚集。

(G)識(shí)別的不同細(xì)胞類型之間的Top DEGs埋哟。

(H)在分區(qū)的Visium數(shù)據(jù)上識(shí)別間皮細(xì)胞(上)和血管平滑肌細(xì)胞(下)標(biāo)志物笆豁。

(I和J)肝包膜(I)或中央靜脈(J郎汪；左)和門脈三聯(lián)征(J；右)所示基因的分子圖闯狱。PV煞赢，門靜脈；CV哄孤，中央靜脈照筑；HA，肝動(dòng)脈瘦陈；BD凝危，膽管。箭頭表示特定的單元格類型晨逝，其中顏色對(duì)應(yīng)于標(biāo)記蛾默。圖像代表2-4只老鼠。另見圖S4和表S3和S4捉貌。

健康人肝臟蛋白質(zhì)基因組圖譜

為了確定小鼠和人類肝臟之間mac亞群及其不同微環(huán)境生態(tài)位之間的保守性程度趴生，我們接下來(lái)使用sc/snRNA-seq和CITE-seq在19例肝活檢中生成了人類肝臟的蛋白質(zhì)基因組圖譜（圖4A、4B昏翰、S6A和S6B苍匆；表S1和S5）。由于Visium能夠可靠地定位小鼠肝細(xì)胞棚菊，我們用它在4次活檢中定位人類肝細(xì)胞（圖4C）浸踩。然而，發(fā)現(xiàn)脂肪變性>10%患者的可見斑點(diǎn)與健康樣本分開聚集（脂肪變性<10%统求；圖4D和4E）检碗。因此，我們使用健康樣本計(jì)算基線分帶码邻，然后將該軌跡轉(zhuǎn)移到脂肪變性樣本上（圖4F和S6F）折剃。這表明脂肪變性主要存在于表達(dá)中央靜脈周圍地帶基因的區(qū)域，如CYP2E1像屋。這與之前的臨床研究相吻合怕犁，該研究表明中央靜脈周圍脂肪變性在非酒精性脂肪肝（NAFLD）患者中最常見，尤其是在早期疾病中己莺。然而奏甫，由于這些中央靜脈周圍區(qū)域比健康對(duì)照組大，這也可能意味著脂肪變性的存在改變了帶狀肝細(xì)胞基因的表達(dá)凌受，但這仍有待測(cè)試阵子。值得注意的是，整體細(xì)胞分布不受脂肪變性的影響胜蛉，盡管中性粒細(xì)胞挠进、單核細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的細(xì)胞在與脂肪變性相關(guān)的脂肪變性患者中優(yōu)先分布在中央靜脈周圍（圖4G）色乾。

KCs在進(jìn)化上保守的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)特性

到目前為止，還沒有真正的人類KC的有效標(biāo)志物被描述领突。在解釋準(zhǔn)確定義人類KC的困難時(shí)暖璧，我們發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞和MACs在人類sc/snRNA-seq數(shù)據(jù)中形成了單一的連續(xù)體，阻止了對(duì)人類KC的簡(jiǎn)單定義(圖4B)攘须。值得注意的是，在NASH小鼠肝臟中也觀察到從單核細(xì)胞到KCs的類似連續(xù)體(圖S5J和S6J-S6N殴泰，表S8)于宙。我們觀察到長(zhǎng)期駐留的表達(dá)Timd4的KC和最近招募的Timd4-單核細(xì)胞來(lái)源的KCs(moKCs；圖S6J-S6N)悍汛。由于在人類肝臟中存在這樣的連續(xù)體捞魁，表明在健康的人類肝臟中也可能有單核細(xì)胞對(duì)KC池的貢獻(xiàn)，我們接下來(lái)放大髓系細(xì)胞來(lái)研究這一點(diǎn)离咐，確定了10個(gè)簇(圖4H谱俭、S60O和S6P；表S2)宵蛀。為了定義KC昆著，我們通過這些簇檢測(cè)了小鼠Top25KC基因的表達(dá)，確定了簇10是真正的人類KC(圖S6Q)术陶。與老鼠不同的是凑懂，它們優(yōu)先位于中央靜脈區(qū)域(圖S6R)。Cluster9也表達(dá)了許多這些基因梧宫，但缺乏TIMD4(圖S6Q)接谨，這表明這些細(xì)胞可能是最近招募的moKCs。肝臟中moKC的存在與在移植供體肝臟中發(fā)現(xiàn)宿主來(lái)源的MACs的報(bào)道是一致的塘匣，并提示KC群體可能是胚胎細(xì)胞和單核細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞的混合體脓豪。雖然在mRNA水平上不是這樣，但在CITE-SEQ數(shù)據(jù)中忌卤，VSIG4被發(fā)現(xiàn)是最好的人類KC蛋白標(biāo)記物扫夜，而FOLR2、CD163和CD169也被鑒定為這些細(xì)胞的有效標(biāo)記物驰徊，用于冰凍切片和石蠟切片的流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡觀察(圖4I和S6S-S6X)历谍。人肝VSIG4蛋白和KC特異性CD5L mRNA和MICS 100-plex蛋白的共同染色分析也證實(shí)了KC的中帶定位(圖4J和S6U)。為了評(píng)估KC的特性在進(jìn)化中是否進(jìn)一步保守辣垒，我們對(duì)獼猴望侈、豬、倉(cāng)鼠勋桶、雞和斑馬魚的肝臟進(jìn)行了分析(圖4K)脱衙。我們通過將保守的人-鼠KC特征基因映射到數(shù)據(jù)集來(lái)識(shí)別KC(圖4K和S7A-S7C)侥猬。然后，我們檢查了所確定的每個(gè)KC種群的主要特征(圖S7D-S7H捐韩；表S9)退唠。可能由于核心KC轉(zhuǎn)錄因子的保守表達(dá)(圖S7I)荤胁，在不同物種之間的轉(zhuǎn)錄本之間觀察到了強(qiáng)烈的重疊瞧预。然而，每個(gè)物種也含有一些獨(dú)特的KC基因(圖S7J仅政；表S9)垢油。VSIG4蛋白在豬和獼猴KC中的表達(dá)也是保守的(圖S7K-S7M)。同樣圆丹，我們也能夠根據(jù)保守基因識(shí)別出大多數(shù)其他種類的肝細(xì)胞(圖S7N和S7O)滩愁。CDC2是主要的例外，因?yàn)樘囟ǖ腸DC2標(biāo)記基因并不是在所有物種中都是保守的(圖S70O)辫封。

圖 4. 跨物種鑒定真正的Kupffer細(xì)胞

[if !supportLists](A)?? [endif]從肝活檢中分離出細(xì)胞/細(xì)胞核

(B) sc/snRNA-seq數(shù)據(jù)的UMAP硝枉。

(C) 4例患者活檢標(biāo)本的Visium數(shù)據(jù)的UMAP。

(D)根據(jù)脂肪變性百分比分割視野點(diǎn)倦微。

(E)健康和脂肪變性肝組織妻味，HE染色識(shí)別脂肪變性區(qū)。

(F) Visium數(shù)據(jù)的分區(qū)(上)與分區(qū)模式映射到肝臟組織(下)欣福。

(G)從sc/snRNA-seq映射到Visium條帶軌跡上的細(xì)胞標(biāo)簽弧可，健康(上)，脂肪變性(下)劣欢。

(H)從圖4B中分離出40,821個(gè)髓系細(xì)胞棕诵，與TotalVI再次聚集。

(I) VSIG4蛋白表達(dá)(上)和CD5L mRNA表達(dá)(下)凿将。

(J) VSIG4校套、F4/80、FOLRB牧抵、GLUL聯(lián)合Cd5l/ Cd5l在小鼠(左)和人(H25;右)肝臟笛匙。

(K) 從健康的獼猴、豬犀变、雞妹孙、倉(cāng)鼠和斑馬魚中分離出肝臟，使用人鼠KC 特征基因識(shí)別KC获枝。

LAM（脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞） 在脂肪肝中的位置發(fā)生了改變

除了KC蠢正，我們還在人類髓系細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了不同的MAC簇（圖4H）。為了更好地理解這些簇的性質(zhì)省店，我們用共焦顯微鏡檢查了人類肝臟中CD68+VSIG4-MAC的具體位置（圖S8A）嚣崭。這確定了CD68+VSIG4-MAC位于肝包膜內(nèi)笨触，靠近中央靜脈和PVs以及膽管（BDs）（圖5A-5C和S8A）。在健康獼猴肝臟的PVs和CVs以及BDs處也觀察到類似的群體（圖S7M）雹舀。對(duì)scRNA-seq數(shù)據(jù)的檢查以及與小鼠特征的比較確定了未成熟和成熟LAM芦劣，未成熟LAM表達(dá)一些單核細(xì)胞基因（圖4H、5D说榆、S8B和S8C）虚吟。盡管最近被認(rèn)為是纖維化人類肝臟特有的，我們?cè)谒惺褂胹cRNA-seq分析的患者中都發(fā)現(xiàn)了LAMs签财，但脂肪變性>10%的肝臟中LAMs的比例有增加的趨勢(shì)（圖S8D）串慰，這與小鼠NAFLD中LAMs的數(shù)量增加一致（圖S6J–S6N）。與健康小鼠一樣荠卷，Visium在非脂肪變性肝臟的門脈區(qū)識(shí)別出人類LAM模庐。然而烛愧，在脂肪變性的人類肝臟中油宜，LAMs主要位于脂肪變性區(qū)域的中央靜脈周圍（圖5E），這表明單核細(xì)胞被招募到健康和肥胖肝臟的不同位置怜姿，然后在那里分化為L(zhǎng)AMs慎冤。激光共聚焦顯微鏡和分子圖進(jìn)一步驗(yàn)證了LAMs位置的改變（圖5F-5H）。然而沧卢，這項(xiàng)分析沒有發(fā)現(xiàn)任何包膜MAC蚁堤，這表明這些細(xì)胞可能在我們的UMAP中缺失，可能是因?yàn)榛顧z時(shí)有少量包膜組織但狭。表達(dá)IGSF21的Mac1群體在組織中的數(shù)量非常少（圖5G和5H）披诗。這與它們和moKC相似的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征相結(jié)合，可能表明它們是在小鼠中觀察到的moKC前體立磁，但這需要進(jìn)一步研究呈队。以LAMs為重點(diǎn)，在小鼠NAFLD模型中也觀察到它們?cè)谥咀冃匀祟惛闻K中位置的變化唱歧。在這里宪摧，在門靜脈、門靜脈周圍和中間區(qū)域發(fā)現(xiàn)了LAM（圖5I颅崩、S8E和S8F）几于，符合這些區(qū)域脂肪變性的存在，并與我們之前的報(bào)告一致沿后。標(biāo)準(zhǔn)飲食（SD）和WD喂養(yǎng)的小鼠LAMs的差異表達(dá)基因比較發(fā)現(xiàn)沿彭，在WD喂養(yǎng)的小鼠中，LAMs具有更成熟的表型尖滚，下調(diào)了一些單核細(xì)胞基因的表達(dá)膝蜈，并增加了原型mac標(biāo)記物的表達(dá)锅移，這與人類肝臟中存在未成熟和成熟LAMs一致（圖5J）。與更成熟的表型相匹配饱搏，WD衍生的LAM與SD LAM相比也表達(dá)較低水平的Il1b非剃、Tnf和Il10（圖5K）。雖然需要進(jìn)一步研究來(lái)評(píng)估這些細(xì)胞在NAFLD中的確切功能推沸，但這可能進(jìn)一步表明LAMs具有保護(hù)作用备绽，而不是致病作用。

圖5.在健康肝臟的膽管中發(fā)現(xiàn)LAM鬓催，但在肥胖肝臟的脂肪變性區(qū)域中發(fā)現(xiàn)LAM

[if !supportLists](A) [endif]用共聚焦顯微鏡觀察健康人肝(H14)被膜上的標(biāo)記物的表達(dá)肺素。比例尺，20毫米宇驾。箭頭表示包膜Mac倍靡。

(B和C)共聚焦顯微鏡下顯示門脈三聯(lián)征標(biāo)志物表達(dá)的代表性圖像。

?(D)使用小鼠膽管LAM基因簽名和簽名查找算法識(shí)別的人膽管LAM课舍。

(E)來(lái)自scRNA-seq的人類LAM簽名被映射到Visium分帶數(shù)據(jù)上塌西，健康(紫色)，脂肪變性(黃色)筝尾。

(F)共聚焦顯微鏡下所示標(biāo)記物的表達(dá)捡需。右邊插圖。比例尺筹淫，150毫米站辉。插入比例尺，75毫米损姜。

(G和H)指示基因在健康(G)和脂肪變性(H)人肝臟中的表達(dá)饰剥。右邊插圖。圖像代表每種情況下有2名患者摧阅。

(I)用西方飲食(WD)或標(biāo)準(zhǔn)飲食(SD)喂養(yǎng)小鼠36周汰蓉，誘發(fā)NAFLD，并進(jìn)行微量分析逸尖。分析來(lái)自SD條件下的1個(gè)肝臟切片和WD條件下的3個(gè)肝臟切片古沥。分區(qū)方式和H&E染色(左)和LAM和KC位置(右)。

(J)顯示SD(紫色)和WD(黃色)喂養(yǎng)小鼠(共24+36周)LAM之間DEG的熱圖娇跟。

(K)從飼喂SD或WD 24周的小鼠肝臟中提取LAMs(在消化前去除包膜)岩齿，提取rna，并用qpcr檢測(cè)與b-actin相關(guān)的基因表達(dá)苞俘。

CD45-肝細(xì)胞在確定巨噬細(xì)胞定位中的潛在作用

鑒于KCs在健康小鼠和人類肝臟中的定位改變盹沈，以及LAM在小鼠和人類健康肝臟和脂肪變性肝臟中的定位變化，我們接下來(lái)試圖調(diào)查這些環(huán)境下Mac細(xì)胞的不同之處。人類肝臟中的CD45-細(xì)胞鑒定出與在健康小鼠肝臟中觀察到的相似(亞)群體的內(nèi)皮細(xì)胞乞封、干細(xì)胞和肝細(xì)胞(圖6A和6B做裙；表S3)。在確定的CD45-的定位方面沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異可以解釋與小鼠相比位置改變的KC細(xì)胞(圖6C和6D)肃晚∶考慮到這一點(diǎn)，我們接下來(lái)利用NicheNet來(lái)檢測(cè)KCs和CD45-只存在于人類體內(nèi)的能夠調(diào)節(jié)KC位置的細(xì)胞关串。該分析鑒定了LSECs表達(dá)的CCL23和CCL14拧廊，肝細(xì)胞表達(dá)的CCL16與人KCs而不是小鼠KCs表達(dá)的CCR1結(jié)合(圖6E)。關(guān)鍵的是晋修，這些配體優(yōu)先位于中央靜脈周圍(圖6F)吧碾，因此代表了關(guān)于KC在人類肝臟中位置潛在調(diào)控的進(jìn)一步研究的有趣目標(biāo)。我們下一步的目標(biāo)是研究CD45-細(xì)胞對(duì)LAM在健康肝臟和脂肪變性肝臟中的位置的調(diào)節(jié)墓卦。鑒于在我們的sc/ snRNA-seq分析中脂肪變性的人類樣本數(shù)量較少倦春，以及患者之間的差異，我們轉(zhuǎn)向小鼠NASH模型來(lái)研究這一點(diǎn)落剪。放大sc(圖6G;表S10)睁本，我們發(fā)現(xiàn)wd喂養(yǎng)的小鼠中成纖維細(xì)胞增加。成纖維細(xì)胞和造血干細(xì)胞在基因表達(dá)譜上有相當(dāng)大的重疊著榴，這表明造血干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間可能存在分化軌跡添履，盡管這一點(diǎn)仍有待體內(nèi)驗(yàn)證屁倔。我們還注意到一個(gè)成纖維細(xì)胞亞群表達(dá)CCL2脑又，CCR2的已知配體，它在NAFLD期間被招募到肝臟的單核細(xì)胞上表達(dá)锐借，以及CD44和Vcam1问麸，兩個(gè)參與單核細(xì)胞招募和粘附的基因。兩種成纖維細(xì)胞群均在門脈周圍脂肪變性區(qū)域富集(圖6I)钞翔，其中我們也觀察到LAM的富集(圖5I)严卖。我們還發(fā)現(xiàn)CCL2和CD44在人成纖維細(xì)胞中高表達(dá)(表S3)，有可能招募膽管LAM布轿。綜上所述哮笆，這表明成纖維細(xì)胞可能在LAM的招募過程中發(fā)揮重要作用。

圖 6. 巨噬細(xì)胞微環(huán)境細(xì)胞可能調(diào)節(jié)健康肝臟和脂肪肝中的巨噬細(xì)胞位置

(A)人CD45-的UMAP汰扭。從圖4B中分離出細(xì)胞(15,481個(gè)細(xì)胞/核)稠肘，并與scVI重新聚集。

(B)識(shí)別的細(xì)胞類型之間的top DEGs萝毛。

(C)來(lái)自sc/snRNA-seq的標(biāo)示細(xì)胞簽名映射到Visium分帶數(shù)據(jù)上项阴，健康(上)，脂肪變性(下)笆包。

(D)分子圖定位不同的CD45-細(xì)胞环揽。

(E)Circos圖顯示NicheNet預(yù)測(cè)KCs和LSEC略荡、HSCs和肝細(xì)胞之間的配體-受體對(duì)(左)，UMAP顯示指示的趨化因子在人肝中正常表達(dá)(右)歉胶，CCR1/CCR1在人和鼠NAFLD肝中正常表達(dá)(下圖)汛兜。

(F)健康和脂肪變性的人類肝臟中指定基因的區(qū)帶。

(G)從圖S5J分離的小鼠NAFLD(SD和WD)基質(zhì)細(xì)胞(4025個(gè)細(xì)胞/核)的UMAP(左)通今，并與scVI重新聚集(左)以及SD和WD喂養(yǎng)的小鼠中每種細(xì)胞類型的比例(右)序无。

(H)細(xì)胞類型之間的top DEGs。

(I) 給小鼠喂食西方飲食（WD）或標(biāo)準(zhǔn)飲食（SD）36周以誘導(dǎo)NAFLD衡创，并進(jìn)行Visium分析帝嗡。

跨物種的差異NicheNet分析揭示了ALK1-BMP9/10軸在KC發(fā)生中的關(guān)鍵作用

在確定了Mac微環(huán)境細(xì)胞在調(diào)節(jié)Mac亞群位置中的潛在作用后，我們接下來(lái)試圖確定這些細(xì)胞在調(diào)節(jié)Mac表型中的參與璃氢。為了評(píng)估保守的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用在推動(dòng)Mac跨物種異質(zhì)性中的作用哟玷，我們對(duì)不同的肝臟MAC和CD45-進(jìn)行了差異NicheNet分析。這揭示了LAM的很少的特定配體-受體對(duì)(圖S8G一也；數(shù)據(jù)未顯示)巢寡，暗示可能是局部因素，如代謝物椰苟，而不是獨(dú)特的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用抑月，可能驅(qū)動(dòng)LAM表型。事實(shí)上舆蝴，這與LAM樣細(xì)胞在包括肥胖脂肪組織谦絮、腦、肺和心臟在內(nèi)的多個(gè)組織中的存在是一致的洁仗。與此相一致层皱，用乙酰化低密度脂蛋白培養(yǎng)的骨髓單核細(xì)胞表達(dá)LAM相關(guān)基因(圖7A)赠潦，表明脂質(zhì)在誘導(dǎo)LAM表型中起主導(dǎo)作用叫胖。相反，對(duì)于KCs她奥，我們發(fā)現(xiàn)多個(gè)配體受體對(duì)在人和鼠之間是保守的(圖7B和S8G)瓮增。其中，激活素受體樣激酶(ALK1)-骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)9/10通路在KCs(ALK1哩俭；由Acvr11編碼)和星狀細(xì)胞(BMP)9/10(分別由Gdf2/Bmp10編碼)之間在七個(gè)物種間被發(fā)現(xiàn)是保守的绷跑，并被預(yù)測(cè)可以控制大量保守的KC基因的表達(dá)(圖7B、7C和S8H)携茂。

為了驗(yàn)證這個(gè)軸在KCs中的作用你踩，我們培育了Fcgr1-Cre*Acvrl1fl/fl小鼠，從CD64表達(dá)的MACs中特異性地消除了ALK1。這導(dǎo)致VSIG4+KCs幾乎完全喪失(圖8D-8F)带膜，表明進(jìn)化上保守的ALK1信號(hào)對(duì)KC至關(guān)重要吩谦。為了確定KC的維持是否需要ALK1，我們培育了Clec4f-Cre*Acvrl1fl/fl小鼠膝藕，只從分化的KC中剔除了ALK1式廷。這揭示了與在Fcgr1-Cre小鼠中觀察到的相對(duì)相似的表型，這表明ALK1也是維持KC所必需的(圖S8I)芭挽。為了直接測(cè)試KC發(fā)育過程中對(duì)ALK1的需求滑废，我們產(chǎn)生了BM嵌合體，CD45.1 Clec4f-DTR小鼠在受到肝臟屏蔽的情況下接受照射袜爪，以避免任何輻射損傷蠕趁。然后用CD45.2Acvrl1fl/fl或Fcgr1CrexAcvrl1fl/fl

BM重組這些小鼠。4周后辛馆，給小鼠一次腹腔注射俺陋。注射DT以耗盡KC，并在7天或13天后確定KC群體內(nèi)的嵌合體(圖7G)昙篙。我們觀察到腊状，在第7天，KO BM來(lái)源的細(xì)胞在KC池中幾乎完全被WT BM來(lái)源的細(xì)胞擊敗苔可。這在單核細(xì)胞中沒有觀察到缴挖，但在VSIG4-MACs證明ALK1對(duì)于早期KC的發(fā)展是至關(guān)重要的(圖7H)。

最后焚辅，雖然NicheNet預(yù)測(cè)來(lái)自星狀細(xì)胞的BMP9/10將通過ALK1發(fā)出信號(hào)映屋，誘導(dǎo)KC的發(fā)育和維持，這一預(yù)測(cè)與我們之前的NicheNet分析一致法焰，但最近的另一項(xiàng)研究表明秧荆，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)b信號(hào)將對(duì)KC很重要倔毙。這一預(yù)測(cè)是基于Smad4信號(hào)做出的埃仪，Smad4信號(hào)是TGF-b受體和ALK1誘導(dǎo)的信號(hào)的共同下游效應(yīng)因子。由于TGF-b也被發(fā)現(xiàn)參與了含有ALK1-TGF-b受體的信號(hào)復(fù)合體陕赃，因此我們研究了TGF-b信號(hào)對(duì)KCs是否重要卵蛉。為此，我們利用了ALK1-Fc陷阱或TGF-bII型受體(TGFbRII)-Fc陷阱以及適當(dāng)?shù)耐蛯?duì)照么库。ALK1-Fc選擇性地隔離BMP9/10傻丝，而TGFbRII-Fc選擇性地干擾TGFb1/TGF-b3受體結(jié)合。清除Clec4f-DTR小鼠的KC诉儒，同時(shí)用受體Fc陷阱或同型對(duì)照進(jìn)行治療葡缰，7天后檢查KC的發(fā)育情況(圖7I)。與嵌合體研究一致，ALK1-Fc可顯著抑制KC的發(fā)展泛释，但阻斷TGFb信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)VSIG4-Mac僅有很小的影響(圖7J)滤愕。總之怜校，這證實(shí)了NicheNet的預(yù)測(cè)间影，并表明進(jìn)化上保守的ALK1-BMP9/10軸對(duì)KC的發(fā)育和維持至關(guān)重要。

圖7.ALK1-BMP9/10軸調(diào)節(jié)KC發(fā)育

(A)小鼠骨髓單核細(xì)胞在CSF1和特定濃度的人ac-LDL存在下培養(yǎng)茄茁，然后用qPCR分析指示基因的表達(dá)魂贬。數(shù)據(jù)來(lái)源于2個(gè)實(shí)驗(yàn)。用Bonferroni進(jìn)行單因素方差分析后檢驗(yàn)裙顽，與0 ng/mL進(jìn)行比較付燥。

(B)NicheNet Circos圖突出顯示人類和小鼠的KCs和指定的微環(huán)境細(xì)胞之間保守的配體-受體對(duì)和誘導(dǎo)的靶基因。

(C)顯示ALK1(Acvrl1)在人髓系細(xì)胞(左)和GDF2/BMP10在CD45-中表達(dá)的特征圖 (右)愈犹。

(D)取Fcgr1-CrexAcvrl1fl/fl小鼠机蔗、Acvrl1fl/fl或Acvrl1+/+對(duì)照小鼠的肝臟，用VSIG4檢測(cè)KCs(左)和定量(右)甘萧。

(E)在Fcgr1-CrexAcvrl1fl/fl或Acvrlfl/fl對(duì)照小鼠中萝嘁，Mac群體所指示的KC標(biāo)記的表達(dá)。數(shù)據(jù)來(lái)源于3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)扬卷，每組n=9牙言。t檢驗(yàn)。

(F)共聚焦顯微鏡觀察Fcgr1-CrexAcvrl1fl/fl怪得、Acvrl1fl/fl或Acvrl1+/+對(duì)照組小鼠肝臟中指示標(biāo)志的表達(dá)咱枉。比例尺，50毫米徒恋。圖像代表每組2只老鼠蚕断。

(G)嵌合體實(shí)驗(yàn)裝置示意圖。

(H)Clec4f-Dtr小鼠在DT部分照射后7天或13天入挣，接受Acvrlfl/fl或Fcgr1-CrexAcvrlfl/fl

Bm治療4周后亿乳，血中Ly6chi單核細(xì)胞的嵌合率恢復(fù)到正常水平。數(shù)據(jù)來(lái)源于2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)径筏，每組10-12只小鼠葛假。

(I)FC捕捉器實(shí)驗(yàn)裝置示意圖。

(J)顯示VSIG4和CLEC2總MACs表達(dá)的代表性FACS圖滋恬。

DISCUSSION

要生成任何人體組織的實(shí)用細(xì)胞圖譜聊训，并解開對(duì)該組織中細(xì)胞的特性至關(guān)重要的細(xì)胞-細(xì)胞回路，需要四條關(guān)鍵信息：(1)所有存在的細(xì)胞的清單恢氯，(2)組織內(nèi)不同細(xì)胞的位置带斑，以識(shí)別相鄰細(xì)胞之間的相互作用鼓寺，(3)允許任何預(yù)測(cè)的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用受到干擾的人和動(dòng)物模型之間的比對(duì)，以及(4)識(shí)別可靠的基于抗體的小組勋磕，以有效地篩查不同的患者和/或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物侄刽。在這里，通過整合單細(xì)胞朋凉、空間轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)州丹，我們?yōu)楦闻K提供了這4條信息，并揭示了控制肝臟巨噬細(xì)胞發(fā)育的進(jìn)化保守的微環(huán)境回路杂彭。

解開所有肝細(xì)胞的空間定位墓毒，我們?cè)诮】档男∈蟆⑷撕瞳J猴的肝臟中發(fā)現(xiàn)了膽管周圍的LAM亲怠。然而所计，當(dāng)脂肪變性出現(xiàn)時(shí)，LAM優(yōu)先招募到肝臟的脂肪變性區(qū)域团秽。這種空間信息至少部分地推翻了LAM身份是由纖維化的SCs特異性誘導(dǎo)的假設(shè)主胧。相反，我們的數(shù)據(jù)表明LAM是由局部脂質(zhì)暴露引起的习勤。我們還提供了七個(gè)物種的肝臟圖譜的比對(duì)踪栋。這揭示了穩(wěn)態(tài)KCs的保守和獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄程序，并揭示了KCs和構(gòu)成其生態(tài)位的細(xì)胞之間的空間受限和保守的配體-受體對(duì)图毕。我們強(qiáng)調(diào)在試圖理解疾病如何擾亂細(xì)胞之前首先表征健康組織的必要性夷都，我們確定DLL-Noch相互作用是穩(wěn)態(tài)LSECs和KCs之間進(jìn)化上保守的相互作用，因此并不是肝細(xì)胞癌或纖維化所獨(dú)有的予颤，正如所提出的囤官。同樣，我們發(fā)現(xiàn)FOLR2的表達(dá)不是腫瘤相關(guān)的肝MACs所特有的蛤虐，而是在健康的小鼠和人的肝臟中由KCs表達(dá)党饮。最后，我們從廣泛的寡核苷酸結(jié)合抗體面板出發(fā)驳庭，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行單細(xì)胞和空間圖譜分析刑顺。這一點(diǎn)至關(guān)重要，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄圖譜并不總是與通過流式細(xì)胞儀或顯微鏡檢測(cè)蛋白質(zhì)的能力相對(duì)應(yīng)嚷掠。

通過廣泛的篩選捏检，我們確定了分離和定位肝臟MACs及其各自細(xì)胞的最佳表面標(biāo)志物。這既可以在單細(xì)胞水平上驗(yàn)證空間位置不皆，也可以有效地篩選KCs丟失的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。使用我們定義的面板對(duì)Fcgr1CrexAcvrl1fl/fl小鼠的特征很容易地證明了ALK1-BMP9/10軸在KC發(fā)育中的關(guān)鍵作用熊楼，強(qiáng)調(diào)了Mac-基質(zhì)細(xì)胞-細(xì)胞間的相互作用比生長(zhǎng)因子的交換更進(jìn)一步霹娄。展望未來(lái)能犯，將這些相對(duì)便宜的抗體面板應(yīng)用于大的患者隊(duì)列或多個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，應(yīng)該能夠有效地識(shí)別任何擾亂肝臟穩(wěn)態(tài)的擾動(dòng)犬耻。