ToneScript cDNA第一鏈合成試劑盒是專門用于兩步法RT-PCR的第一步露筒，含有合成高質(zhì)量第一鏈cDNA所需的所有成分，適用于后續(xù)的PCR敌卓、qPCR以及基因克隆慎式。那么在實(shí)際操作中會有哪些常見問題呢？一起來了解一下：
1、 沒有RT-PCR產(chǎn)物或產(chǎn)量低
◆RNA模板降解瘪吏。RNA的純度和完整對于反轉(zhuǎn)錄得到全長cDNA是非常重要的癣防。提取的RNA應(yīng)進(jìn)行電泳檢測以確定其是否降解。同時RNA要避免多次反復(fù)凍融肪虎。
◆RNA模板純度低劣砍。提取RNA的過程中惧蛹，可能殘留一些鹽離子扇救、試劑，如EDTA香嗓、酚迅腔、胍鹽、磷酸鹽靠娱、多胺等抑制接下來的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)沧烈。建議用75%乙醇（DEPC水配制）仔細(xì)清洗RNA沉淀。
◆引物不合適像云。選擇合適的引物锌雀，當(dāng)RNA是細(xì)菌RNA或者是沒有polyA尾的RNA要選擇隨機(jī)引物或者特異引物。
◆目的基因含有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)或高GC含量迅诬。建議選擇隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄腋逆。將反轉(zhuǎn)錄溫度提高至55℃。
2侈贷、RT-PCR產(chǎn)物比預(yù)期長
◆RNA中很可能污染了DNA惩歉。真核生物基因組DNA中含有內(nèi)含子，可能參與了PCR擴(kuò)增俏蛮，可以在反轉(zhuǎn)錄之前對RNA進(jìn)行DNaseI的消化撑蚌。
3、陰性對照中有RT-PCR產(chǎn)物
◆陰性對照中有RT-PCR產(chǎn)物也表明有DNA的污染搏屑。在反轉(zhuǎn)錄之前對RNA進(jìn)行DNase I的消化争涌。
