隨著單細(xì)胞研究越來越多，基于Single-Cell Sequencing發(fā)表的文章也越來越多更振，涉及領(lǐng)域涵蓋了腫瘤、發(fā)育饭尝、神經(jīng)科學(xué)肯腕、免疫等。如何從龐大測序數(shù)據(jù)中獲得單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜成為數(shù)據(jù)解析的關(guān)鍵點(diǎn)芋肠。CellRanger是10x genomic公司專為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析提供的分析軟件乎芳，可實(shí)現(xiàn)從Illumina原始數(shù)據(jù)（BCL或fastq格式）到文庫拆分，細(xì)胞拆分及定量帖池，pca奈惑，聚類以及可視化（t-SNE和UMAP）結(jié)果。該軟件高度集成化睡汹，即使您不會寫代碼也可以快速掌握其用法肴甸，使單細(xì)胞研究簡單化。
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10x單細(xì)胞標(biāo)記原理
在講軟件用法之前囚巴，先給大家回顧下10x單細(xì)胞標(biāo)記原理（詳細(xì)信息可查看：10X Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)流程和優(yōu)勢）原在，Gel bead（下左圖）由凝膠珠和磁珠上的一段引物構(gòu)成友扰，引物序列構(gòu)成依次為：全長Illumina TruSeq Read 1 測序引物、16nt 10X Barcode序列（每個(gè)Gel bead的10X Barcode均不相同庶柿，形成GEM后用于區(qū)分細(xì)胞）村怪、12 nt unique molecular identifier (UMI) （區(qū)分同一細(xì)胞的不同轉(zhuǎn)錄本并去除PCR Duplications，實(shí)現(xiàn)絕對定量）浮庐、30 nt poly dT反轉(zhuǎn)錄引物甚负。最終形成的文庫結(jié)構(gòu)為下圖：
Tips：對于V2試劑（如5’轉(zhuǎn)錄組），10x Barcode-16nt审残，UMI-10nt（比V3試劑少2nt）梭域，10x Barcode+UMI=26nt
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Cell Ranger軟件下載與安裝
1）該軟件的官方下載網(wǎng)址：
https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest 目前該軟件更新至3.1.0版本（2019-7-24），下載完成后（提醒：需要注冊并登陸才能下載）搅轿，直接解壓即可使用病涨，無需安裝，方便快捷璧坟。
2）對應(yīng)庫文件的下載
官方已經(jīng)提供了用于cellranger分析的了人（Human reference (GRCh38)及Human reference (hg19)）既穆，小鼠（Mouse）及Human (hg19) and mouse 的reference。如果您的樣本來自這兩個(gè)物種建議直接下載用于后續(xù)的分析雀鹃，下載路徑同上循衰。如果您研究的對象不是人和小鼠，不用擔(dān)心褐澎，cellranger也有專門用于構(gòu)建reference的指令会钝。具體指令如下：
正常的輸出文件結(jié)構(gòu)如下：
Tips：如果您的基因組比較大，運(yùn)行該代碼時(shí)可能會報(bào)內(nèi)存的錯誤工三，添加參數(shù)--memgb進(jìn)行調(diào)整迁酸，該參數(shù)默認(rèn)16 （GB）。對于超大基因組（如小麥）俭正，染色體長度超過512M的基因組需要進(jìn)行拆分奸鬓，否則后續(xù)cellranger分析無法進(jìn)行下去。
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Cell Ranger分析pipeline
cellranger mkfastq文庫拆分
Cell Ranger封裝了bcl2fastq軟件掸读，可以基于Illumina下機(jī)的原始數(shù)據(jù)（BCL格式）進(jìn)行數(shù)據(jù)拆分却邓，得到fastq數(shù)據(jù)薄料。一般情況下，GEO數(shù)據(jù)庫下載的數(shù)據(jù)或公司提供的數(shù)據(jù)基本上都是拆分后的fastq，因此這步可以不用運(yùn)行胰默。該模塊的原理及使用方法如下：
--id 由mkfastq創(chuàng)建的文件夾的名稱
--run Illumina BCL run文件夾路徑
--csv 包含lane夸政，sample和index的文件练慕，格式如下：
輸出文件結(jié)果如下：
Tips：由于10x測序數(shù)據(jù)量龐大贴浙，為了保證讀取的準(zhǔn)確性，每個(gè)10x sample_Index包含4個(gè)8堿基的引物（其中每個(gè)堿基位置上均包含了ATCG堿基）铛铁，樣本對應(yīng)的Index需仔細(xì)核對隔显。
cellranger count細(xì)胞及基因定量聚類等分析
count是cellranger軟件最重要核心的部分却妨，可以完成細(xì)胞鑒定，基因組比對括眠，基因定量彪标，細(xì)胞降維，聚類掷豺，差異分析等功能捐下。
--id 輸出結(jié)果文件夾
--tranome reference 所在文件夾
--fastqs 樣本對應(yīng)測序fastq 所在文件夾
--sample 樣本名，即mkfastq輸出的樣本名
Tips：--id參數(shù)不能寫絕對路徑萌业，因此如果需要輸出到指定路徑下，需要先通過cd到輸出結(jié)果路徑奸柬，fastq對應(yīng)的數(shù)據(jù)格式應(yīng)為：subject1_S1_L001_R1_001.fastq.gz生年，設(shè)置--sample=subject1，除這些參數(shù)外廓奕，還可以設(shè)置線程數(shù)和內(nèi)存以及reads長度抱婉，預(yù)計(jì)細(xì)胞數(shù)，強(qiáng)制細(xì)胞數(shù)等參數(shù)桌粉，其他參數(shù)可在官方網(wǎng)站查看學(xué)習(xí)
輸出文件結(jié)果如下：
結(jié)果文件說明：
metrics_summary.csv 匯總指標(biāo)csv格式蒸绩，表格信息來自html中的summary部分
possorted_genome_bam.bam reads 比對基因組bam文件
filtered_feature_bc_matrix 過濾后的細(xì)胞和基因及對應(yīng)的定量信息
raw_feature_bc_matrix 原始的細(xì)胞和基因及對應(yīng)的定量信息
Analysis tsne，差異分析等二級分析相應(yīng)的輸出結(jié)果
molecule_info.h5 多樣本整合aggr分析輸入文件
cloupe.cloupe 配套軟件Loupe Cell Browser 輸入文件
Tips：cellranger count并不能對一些低質(zhì)量的細(xì)胞（比如線粒體表達(dá)高處于凋亡的細(xì)胞）以及可能包含多個(gè)細(xì)胞的結(jié)果進(jìn)行過濾铃肯。
cellranger aggr GEM文庫整合
當(dāng)實(shí)驗(yàn)中用到了多個(gè)GEM well患亿，需要整合分析時(shí)，選擇該分析押逼，該分析是基于單個(gè)樣本cellranger count分析得到的molecule_info.h5步藕，進(jìn)一步整合分析的。分析得到的結(jié)果結(jié)構(gòu)與cellranger count結(jié)果結(jié)構(gòu)基本一致挑格，這里不再詳細(xì)介紹咙冗。
--id 輸出結(jié)果文件夾
--csv 樣本對應(yīng)cellranger count輸出結(jié)果文件，格式如下：
Tips：如果需要整合的樣本中既有用v2試劑又有用v3試劑的漂彤，在第三列加入相應(yīng)樣本對應(yīng)的試劑信息雾消，如果只用了一種試劑，只保留前兩列的信息即可挫望。
cellranger reanalyze
相比于count和aggr立润，reanalyze接受更多的可選的參數(shù)，更進(jìn)一步分析媳板，相應(yīng)的分析指令及參數(shù)請參考：https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/reanalyze
一文輕松玩轉(zhuǎn)10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組官方分析軟件CellRange | 單細(xì)胞專題_fastq (sohu.com)
