導(dǎo)語(yǔ)：
每年的歲末年初见剩，《自然》雜志旗下子刊《自然·方法》（Nature Methods）都會(huì)盤(pán)點(diǎn)當(dāng)年的年度科學(xué)技術(shù)蓬衡。2015年最受關(guān)注的技術(shù)為冷凍電鏡技術(shù)（cryo-EM）喻杈，此前呼聲很高的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)未能折桂。
在冷凍電鏡的這場(chǎng)技術(shù)革命中狰晚，華人科學(xué)家功不可沒(méi)筒饰，在某些方面甚至獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷，做出了諸多重大成果壁晒。
文?|張凱（劍橋大學(xué)MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室博士）
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細(xì)胞里面的生命活動(dòng)井然有序瓷们，每一個(gè)部分都有其特定的結(jié)構(gòu)，承擔(dān)不同的功能秒咐。生物大分子則是一切生命活動(dòng)的最終執(zhí)行者谬晕，它們主要是核酸和蛋白。核酸攜帶了生命體的遺傳信息携取，而蛋白是生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者攒钳。自現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生以來(lái)的半個(gè)世紀(jì)里，解析和分析生物大分子的結(jié)構(gòu)雷滋、進(jìn)而闡釋其功能機(jī)制一直都是現(xiàn)代生命科學(xué)的核心問(wèn)題之一不撑。
事實(shí)上文兢，一切自然科學(xué)都涉及物質(zhì)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)間的相互作用為核心的研究方向，天文學(xué)研究宇宙焕檬、星體等的結(jié)構(gòu)及其相互作用姆坚，粒子物理研究物質(zhì)世界的基本粒子的結(jié)構(gòu)和相互作用，甚至包括應(yīng)用性很強(qiáng)的材料科學(xué)都是以研究新型材料的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等為核心实愚。結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的直接目的是弄清楚生命大分子結(jié)構(gòu)兼呵，從而更好地理解生命，理解這個(gè)自然界中“逆熱力學(xué)第二定律”而誕生的奇跡爆侣；最終目標(biāo)是公眾通常關(guān)心的實(shí)用價(jià)值萍程。
像數(shù)學(xué)物理公式不會(huì)直接造出飛機(jī)、導(dǎo)彈兔仰、計(jì)算機(jī)一樣茫负，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)這樣的基礎(chǔ)研究不會(huì)直接轉(zhuǎn)化為人們生產(chǎn)生活的必須物品。比較具體的應(yīng)用乎赴，如藥物設(shè)計(jì)忍法、疫苗開(kāi)發(fā)、醫(yī)療診斷和蛋白質(zhì)分子性能改造（如科學(xué)實(shí)驗(yàn)或工業(yè)生產(chǎn)中酶活性穩(wěn)定性?xún)?yōu)化）等是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究比較容易被大眾所理解的一個(gè)方向榕吼，但卻只是其研究?jī)r(jià)值的一個(gè)側(cè)面而已饿序。
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)如同生命科學(xué)里的數(shù)學(xué)公式和物理定律，甚至在以后會(huì)充當(dāng)生命科學(xué)里面的“化學(xué)元素周期表”羹蚣，除了幫助發(fā)現(xiàn)或設(shè)計(jì)新藥等原探，它更重要的價(jià)值是作為最基礎(chǔ)最上游的研究之一，通過(guò)影響一切與其密切相關(guān)的下游科學(xué)和技術(shù)顽素，從而改變我們的世界咽弦。
結(jié)構(gòu)生物學(xué)最早誕生于上個(gè)世紀(jì)中葉，它是一門(mén)通過(guò)研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)來(lái)闡明生命現(xiàn)象的學(xué)科胁出，在其發(fā)展史上有兩個(gè)里程碑式的事件型型，一個(gè)是DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，另一個(gè)肌紅蛋白（Myglobin）晶體結(jié)構(gòu)的解析全蝶，這兩個(gè)事件都是上個(gè)世紀(jì)最重要的革命性科學(xué)進(jìn)展闹蒜，均在劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，并且都于1962年獲得了諾貝爾獎(jiǎng)（一個(gè)生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)抑淫，一個(gè)化學(xué)獎(jiǎng)）绷落。同時(shí)它們都是最早使用X射線(xiàn)的方法來(lái)解析生物大分子結(jié)構(gòu)子眶，而這個(gè)方法在過(guò)去半個(gè)世紀(jì)里抗俄，一直占據(jù)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的統(tǒng)治地位显熏。
在當(dāng)今結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中普遍使用的冷凍電鏡渠驼，是上個(gè)世紀(jì)七八十年代開(kāi)始出現(xiàn)彭雾、近兩年飛速發(fā)展的革命性技術(shù)感混，它可以快速态兴、簡(jiǎn)易页衙、高效、高分辨率解析高度復(fù)雜的超大生物分子結(jié)構(gòu)（主要是蛋白質(zhì)和核酸）函似，在很大程度上取代并且大大超越了傳統(tǒng)的X射線(xiàn)晶體學(xué)方法槐脏。
革命性的冷凍電鏡技術(shù)
冷凍電鏡并不是這兩年才建立的。在蛋白質(zhì)X射線(xiàn)晶體學(xué)誕生大約10多年以后的1968年撇寞，?作為里程碑式的電鏡三維重構(gòu)方法顿天，同樣在劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室誕生，Aron?Klug教授因此獲得了1982年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)蔑担。另一些突破性的技術(shù)在上世紀(jì)70年代和80年代中葉誕生牌废，主要是冷凍成像和蛋白快速冷凍技術(shù)。這里面的代表科學(xué)家有Ken?Taylor,?Robert?Glaeser和Jacques?Dubochet等啤握。
快速冷凍可以使蛋白質(zhì)和所在的水溶液環(huán)境迅速?gòu)娜芤簯B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡB(tài)鸟缕，玻璃態(tài)能使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保持其天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)，如果以緩慢溫和的方式冷凍排抬，這個(gè)過(guò)程會(huì)形成晶體冰懂从，生物分子的結(jié)構(gòu)將被晶格力徹底損壞。低劑量冷凍成像能夠保存樣品的高分辨率結(jié)構(gòu)信息蹲蒲，確保了從電鏡圖形中解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可能性番甩。與此同時(shí)Joachim?Frank等則在電鏡圖像處理算法方面奠定和發(fā)展了這項(xiàng)技術(shù)的理論基礎(chǔ)。由此冷凍電鏡的雛形基本建立届搁，總的思路為：
1）樣品冷凍（保持蛋白溶液態(tài)結(jié)構(gòu)）缘薛；
2）冷凍成像（獲取二維投影圖像）；
3）三維重構(gòu)（從二維圖像通過(guò)計(jì)算得到三維密度圖）卡睦。
該方法為生物大分子結(jié)構(gòu)研究提供了一個(gè)和X射線(xiàn)晶體學(xué)完全不一樣的宴胧、全新的思路。但是由于技術(shù)方法的瓶頸么翰，在此后30多年的時(shí)間里只能做一些相對(duì)低分辨率的結(jié)構(gòu)解析工作牺汤，在分辨率上一直不能和X射線(xiàn)晶體學(xué)比較辽旋，甚至一度被嘲笑為”blob-ology“（英文諷刺語(yǔ)浩嫌，“一坨輪廓的技術(shù)”）。
但對(duì)于冷凍電鏡來(lái)說(shuō)溶其，技術(shù)難點(diǎn)遠(yuǎn)非單純冷凍骚腥。冷凍成像和圖像處理算法一直都是瓶頸。從冷凍電鏡技術(shù)誕生以來(lái)的近30年時(shí)間里瓶逃，其一直都有進(jìn)展束铭，只是相對(duì)比較緩慢廓块。
最重要的革命性事件大約發(fā)生在兩三年前：一個(gè)是直接電子探測(cè)器的發(fā)明，另一個(gè)是高分辨率圖像處理算法的改進(jìn)契沫。MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的兩位科學(xué)家Richard?Henderson和Sjors?Scheres在這次革命中起了關(guān)鍵作用（作者注：現(xiàn)代科技革命往往是諸多研究機(jī)構(gòu)若干團(tuán)隊(duì)共同參與带猴，此處僅列舉關(guān)鍵代表，并且僅從技術(shù)角度討論懈万，不涉及生物學(xué)應(yīng)用）拴清。
Richard?Henderson是探測(cè)器方面的先驅(qū)，而Sjors?Scheres則因他設(shè)計(jì)的Relion程序而名聲大噪会通，他們由此當(dāng)選為《自然》雜志2014年“十大科學(xué)進(jìn)展年度人物”口予。兩位科學(xué)家一個(gè)從硬件，一個(gè)從軟件將冷凍電鏡技術(shù)推向了巔峰涕侈，將冷凍電鏡技術(shù)的分辨率推向了新高度沪停。（作者注:?Henderson教授的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)非探測(cè)器一個(gè)方面，包括冷凍電鏡理論基礎(chǔ)驾凶、算法牙甫、軟件，重要生物大分子應(yīng)用调违，如曾首次解析視紫紅質(zhì)跨膜螺旋等等方面窟哺；早在20多年前，他就通過(guò)一系列理論分析技肩，預(yù)言了冷凍電鏡研究的尺度且轨、分辨率極限、技術(shù)瓶頸等等虚婿，并且斷言：冷凍電鏡將超越其它一切技術(shù)方法旋奢，成為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的主導(dǎo)工具，如今這些預(yù)言全部應(yīng)驗(yàn)然痊。）
和此前使用的CCD相比至朗，新發(fā)展的直接電子探測(cè)器不僅在電鏡圖形質(zhì)量上有了質(zhì)的飛躍，同時(shí)在速度上大幅提高剧浸，還可以以電影的形式快速記錄電鏡圖像锹引。這些特性同時(shí)也伴隨著電鏡圖像處理方面的重大變革，電鏡技術(shù)此前在分辨率上的一個(gè)主要瓶頸是電子束擊打生物樣品造成的圖像漂移和輻射損傷唆香。有了快速電影記錄嫌变，我們就可以追蹤圖像漂移軌跡而對(duì)圖像做運(yùn)動(dòng)矯正和輻射損傷矯正，大大提高數(shù)據(jù)質(zhì)量躬它。
盡管如此腾啥，電鏡圖像處理一直都是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)，主要的問(wèn)題是冷凍電鏡的圖像噪音極高、信號(hào)極低倘待，而我們的目標(biāo)是從中提取近原子分辨率的結(jié)構(gòu)信息疮跑，這就像在一個(gè)機(jī)器轟鳴的工廠里監(jiān)測(cè)一只螞蟻爬行的聲音。冷凍電鏡科學(xué)家就是要完成這項(xiàng)艱巨的任務(wù)凸舵，并且真的做到了祸挪。有了硬件和軟件方面的雙重提高，冷凍電鏡的分辨率目前已得到了極大的提高贞间，可以和晶體學(xué)相媲美贿条；并且在其它方面已經(jīng)大大超越了晶體學(xué)。
主要體現(xiàn)在下面幾個(gè)方面：
第一增热，不需要結(jié)晶整以，研究對(duì)象范圍大大擴(kuò)展，研究速度大大提高峻仇。對(duì)于小分子公黑，比方說(shuō)無(wú)機(jī)鹽礦物質(zhì)等自發(fā)就能長(zhǎng)出晶體，小而且穩(wěn)定的蛋白質(zhì)目前來(lái)說(shuō)結(jié)晶并不困難摄咆，但是這類(lèi)意義重大的蛋白幾乎都已經(jīng)解析完了凡蚜，在科學(xué)上沒(méi)有任何重大意義；當(dāng)今時(shí)代吭从，小蛋白已經(jīng)完全不能滿(mǎn)足科學(xué)家們強(qiáng)烈的探索欲望朝蜘，結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的對(duì)象越來(lái)越大，體系越來(lái)越復(fù)雜涩金，結(jié)晶幾乎成為不可能的事情谱醇，即使能結(jié)晶，也不一定衍射步做，有衍射也不一定能得到原子分辨率結(jié)構(gòu)副渴。
很多年前，許多蛋白質(zhì)晶體科學(xué)家為了完成一項(xiàng)艱巨的任務(wù)全度，一個(gè)課題少則5到10年煮剧，多則20年，核糖體從上世紀(jì)80年代初首次長(zhǎng)出晶體到2000年左右最終拿到原子分辨率結(jié)構(gòu)整整經(jīng)歷了20年将鸵；線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物I從上世紀(jì)90年代初研究勉盅，第一次報(bào)道完整晶體結(jié)構(gòu)大約是20年以后。
而冷凍電鏡方法跳過(guò)超大分子復(fù)合物結(jié)晶難的這層技術(shù)屏障咨堤，以直接解析復(fù)合物的溶液狀態(tài)的結(jié)構(gòu)為目標(biāo)菇篡。
現(xiàn)在利用這項(xiàng)技術(shù)漩符，在MRC-LMB一周時(shí)間就可以解析一個(gè)新的核糖體結(jié)構(gòu)一喘；英國(guó)皇家學(xué)會(huì)主席、MRC-LMB結(jié)構(gòu)中心主任Venki?Ramakrishnan?教授，因?yàn)楹颂求w的晶體結(jié)構(gòu)研究而獲得2009年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)凸克。他的實(shí)驗(yàn)室在2014年發(fā)表了最后一篇晶體結(jié)構(gòu)文章议蟆，此后的文章全部以冷凍電鏡為主。哥倫比亞大學(xué)有一個(gè)非常執(zhí)著的博士后萎战，研究蘭尼堿受體（Ryanodine?Receptor）晶體結(jié)構(gòu)長(zhǎng)達(dá)十年之久咐容，最后放棄了晶體，轉(zhuǎn)向了冷凍電鏡技術(shù)蚂维，同時(shí)與清華大學(xué)教授顏寧和LMB的Scheres研究組合作戳粒，幾個(gè)月就解決了這個(gè)難題，并且達(dá)到近原子分辨率虫啥。
第二蔚约，樣品需求量小，樣品制備快涂籽，可重復(fù)性高苹祟。重要生物樣品都是非常珍貴的，總體來(lái)說(shuō)是以微克或者最多以毫克來(lái)計(jì)量评雌，即使得到這點(diǎn)樣品树枫，也要花費(fèi)生物學(xué)家?guī)字堋讉€(gè)月甚至更長(zhǎng)的時(shí)間（大多數(shù)時(shí)候都需要摸索各種條件使樣品處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)景东，以便做進(jìn)一步結(jié)構(gòu)研究）砂轻。
蛋白質(zhì)晶體一般要求高濃度大體積，沒(méi)有量變就沒(méi)有質(zhì)變斤吐。而同樣量的蛋白可以稀釋以后制備若干冷凍電鏡樣品舔清，每個(gè)樣品有成百上千的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域有幾百個(gè)小孔曲初，每一個(gè)小孔甚至可以收集多張照片体谒。解析一般蛋白的原子結(jié)構(gòu)需要幾萬(wàn)個(gè)顆粒，而對(duì)于高對(duì)稱(chēng)性的樣品幾千個(gè)顆粒就足夠臼婆。
第三抒痒，可以研究天然的、動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)颁褂。X射線(xiàn)晶體學(xué)研究生物大分子結(jié)構(gòu)的一個(gè)主要弱點(diǎn)是無(wú)法拿到天然的動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)故响，這是因?yàn)檠芯咳藛T無(wú)論如何也無(wú)法繞開(kāi)結(jié)晶這個(gè)過(guò)程。冷凍電鏡就是要做這件事情：直接解析天然的颁独、溶液態(tài)的彩届、動(dòng)態(tài)的（dynamic），甚至原位(in?situ)的結(jié)構(gòu)誓酒，從而理解生命分子如何在空間和時(shí)間兩個(gè)尺度上以活的動(dòng)態(tài)的方式發(fā)揮功能樟蠕。
晶體學(xué)只能?chē)L試不同的條件獲得生物大分子某個(gè)或者某些固定的狀態(tài)贮聂，而且容易出現(xiàn)晶體堆積引起的不真實(shí)相互作用方式。形象地說(shuō)寨辩，冷凍電鏡可以制作完整的高清電影吓懈，晶體學(xué)只能從電影里截屏。
第四靡狞，技術(shù)革命還將開(kāi)啟巨大的潛在醫(yī)療價(jià)值耻警。冷凍電鏡技術(shù)方法在時(shí)間和精度方面的大幅度提高有時(shí)會(huì)導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的重大科學(xué)和應(yīng)用價(jià)值。比如甸怕，活體病毒結(jié)構(gòu)分析如果可以在分鐘級(jí)別完成甘穿，這將有可能轉(zhuǎn)化為潛在的醫(yī)療檢測(cè)手段：從病人體內(nèi)抽取血樣或感染組織細(xì)胞，幾分鐘以后梢杭，非常清晰明了地展現(xiàn)病人在細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)層面的異常狀況扒磁，甚至給出局部的原子結(jié)構(gòu)圖，從而給出精準(zhǔn)的治療方案式曲。這個(gè)想法現(xiàn)在可能聽(tīng)起來(lái)有點(diǎn)像笑話(huà)妨托，或許再過(guò)若干年人們就不這樣認(rèn)為了。
當(dāng)然冷凍電鏡的革命性不僅僅體現(xiàn)在上述四方面吝羞，在此就不一一列舉兰伤。有關(guān)冷凍電鏡更加詳細(xì)的介紹，可參見(jiàn)筆者等2010年的中文綜述（《生物物理學(xué)報(bào)》钧排，2010年7月敦腔，第26卷，第7期:?533-559）恨溜。文章中對(duì)未來(lái)幾年的發(fā)展趨勢(shì)所做的展望符衔，如直接電子探測(cè)器的普及、非對(duì)稱(chēng)性蛋白復(fù)合物近原子分辨率結(jié)構(gòu)解析糟袁、冷凍電鏡相關(guān)計(jì)算性能的大規(guī)模提升等等判族，目前絕大多數(shù)都在過(guò)去的兩三年內(nèi)得以實(shí)現(xiàn)并飛速發(fā)展。
華人學(xué)者在冷凍電鏡領(lǐng)域的貢獻(xiàn)
在冷凍電鏡的這場(chǎng)技術(shù)革命中项戴，華人科學(xué)家功不可沒(méi)形帮，在某些方面甚至獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷，做出了諸多重大成果周叮。
加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）的華人科學(xué)家程亦凡教授在2013年底辩撑，首次利用冷凍電鏡技術(shù)解析近原子分辨率膜蛋白結(jié)構(gòu)，這項(xiàng)成果在業(yè)界引起了巨大轟動(dòng)仿耽。原因在于當(dāng)所有電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)家還在討論膜蛋白到底能不能利用冷凍電鏡技術(shù)看到二級(jí)結(jié)構(gòu)合冀，也是通常我們認(rèn)為的中等分辨率水平的時(shí)候，程亦凡教授研究組直接解析了TRPV1?這個(gè)膜蛋白3.3埃近原子分辨率的結(jié)構(gòu)（Nature项贺，504：107–112）君躺。
筆者曾在該文章發(fā)表的半年前在一次國(guó)際會(huì)議上和冷凍電鏡領(lǐng)域頂級(jí)學(xué)者深入討論過(guò)如何獲得清晰的膜蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)峭判，對(duì)方給出了悲觀的結(jié)論：“恐怕不太可能，至少最近兩年不可能”晰洒。
事實(shí)上，此前蛋白質(zhì)晶體學(xué)家已經(jīng)有所耳聞“冷凍電鏡可能在未來(lái)幾年會(huì)超越并且取代晶體學(xué)”啥箭，但是誰(shuí)也沒(méi)想到會(huì)是以這樣快速和震撼的方式登場(chǎng)谍珊，這在某種程度上引發(fā)了不少蛋白質(zhì)晶體學(xué)家的“職業(yè)恐慌感”。這項(xiàng)成果的兩個(gè)共同第一作者廖茂福急侥、曹爾虎也都是非常杰出的青年華人科學(xué)家砌滞。
加州大學(xué)洛杉磯分校的周正洪教授早在2008年到2010年左右，在這場(chǎng)電鏡技術(shù)革命來(lái)臨之前坏怪，在各項(xiàng)技術(shù)條件尚未成熟的情況下解析了一系列近原子分辨率病毒結(jié)構(gòu)贝润。當(dāng)時(shí)采用的是傳統(tǒng)膠片來(lái)成像，任務(wù)非常艱巨铝宵，連他還在上學(xué)的兒子也都幫忙一起洗膠片打掘。張興博士在這一系列稍早的重要成果中充當(dāng)了先鋒。早在2008年鹏秋，第一個(gè)近原子分辨率的冷凍結(jié)構(gòu)尊蚁，也即3.8埃輪狀病毒就是張興博士作為第一作者完成的（PNAS,?105(6):?1867-1872）。從1968年Aaron?Klug創(chuàng)立電鏡三維重構(gòu)理論侣夷，到2008年人們首次看到通過(guò)冷凍電鏡獲得近原子分辨率結(jié)構(gòu)横朋，整整用了40年。
在國(guó)內(nèi)百拓，清華大學(xué)的隋森芳院士是我國(guó)冷凍電鏡領(lǐng)域的先驅(qū)琴锭，不僅德高望重，還培養(yǎng)了一大批優(yōu)秀的青年科學(xué)家衙传，包括清華大學(xué)的王宏偉教授以及MRC-LMB的白曉晨和暢磊福博士等等决帖。王宏偉早年在隋老師實(shí)驗(yàn)室做研究生的時(shí)候，在我國(guó)研究設(shè)備和條件全面落后于國(guó)外的情況下依舊做出了許多非常出色的工作蓖捶。
MRC-LMB的多位青年華人研究人員對(duì)冷凍電鏡發(fā)展都做出了重要貢獻(xiàn)古瓤。白曉晨博士在MRC-LMB首次使用直接電子探測(cè)設(shè)備Falcon?I和Sjors?Scheres博士的新程序Relion，獲得了第一個(gè)不對(duì)稱(chēng)樣品核糖體的近原子分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)腺阳，打響了冷凍電鏡革命的第一槍?zhuān)S后解析了一系列核糖體和蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)落君。暢磊福博士在LMB首次獲得非核糖體不對(duì)稱(chēng)蛋白樣品APC復(fù)合物的近原子分辨率結(jié)構(gòu)，闡明了蛋白質(zhì)泛素化的重要機(jī)理亭引。筆者主要在LMB的Andrew?Carter博士實(shí)驗(yàn)室從事動(dòng)力蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究绎速，并成功解析動(dòng)力蛋白激活因子Dynactin結(jié)構(gòu)，提出了目前為止動(dòng)力蛋白最詳盡可靠的運(yùn)動(dòng)和激活機(jī)制（Science,?347(6229):1441-1446.?封面文章）焙蚓，同時(shí)獨(dú)立發(fā)展冷凍電鏡技術(shù)方法纹冤。
1953年4月25日洒宝，MRC沃森和克里克在《自然》雜志發(fā)表DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，61年后的同一天萌京，我國(guó)科學(xué)家雁歌、中科院生物物理研究所的朱平和李國(guó)紅研究員在《科學(xué)》雜志以長(zhǎng)文形式發(fā)表了30nm染色質(zhì)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（DNA雙螺旋之雙螺旋）（Science?,?344(6182):?376-380）。這項(xiàng)工作是冷凍電鏡在核心生命科學(xué)問(wèn)題中的成功應(yīng)用知残，冷凍電鏡部分的工作主要是筆者在生物物理所的同學(xué)宋峰博士完成的靠瞎。
生物物理所的程凌鵬博士（當(dāng)前單位為清華大學(xué)）獲得國(guó)內(nèi)本土第一個(gè)原子分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了蠶多角體病毒（CPV）的完整三維原子模型（PNAS求妹，108(4)：1373-1378）乏盐。筆者也參與了部分工作,?被其高質(zhì)量、干凈的電子密度圖震撼制恍。近期程凌鵬與劉紅榮博士合作父能，在國(guó)際上首次發(fā)表了CPV完整基因組和RNA聚合酶“原位三維結(jié)構(gòu)”?(Science,?2015,?349(6254):1347-50),?引起了很大轟動(dòng)，這項(xiàng)成果是我國(guó)本土冷凍電鏡技術(shù)和生物學(xué)應(yīng)用的雙重突破净神，被多名同行科學(xué)家稱(chēng)贊為”里程牌式發(fā)現(xiàn)“何吝。
我國(guó)著名科學(xué)家施一公最近發(fā)表了一系列重大蛋白復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，包括γ-secretase鹃唯、spliceosome等岔霸，被譽(yù)為過(guò)去幾十年我國(guó)科學(xué)家對(duì)基礎(chǔ)生物學(xué)領(lǐng)域的最大貢獻(xiàn)。
另外俯渤，在歐美和中國(guó)本土還有一大批華人學(xué)者在冷凍電鏡或密切相關(guān)領(lǐng)域（cryoET等）做出諸多突破性成果呆细，例如匹茲堡大學(xué)的張佩君教授（艾滋病毒結(jié)構(gòu)研究），德克薩斯大學(xué)的劉俊教授（細(xì)菌運(yùn)動(dòng)八匠，噬菌體結(jié)構(gòu)等研究）等絮爷，由于時(shí)間和篇幅問(wèn)題，無(wú)法一一介紹梨树。
冷凍電鏡的未來(lái)展望
冷凍電鏡技術(shù)目前仍然在快速發(fā)展中坑夯，未來(lái)冷凍電鏡能做什么取決于這項(xiàng)技術(shù)能發(fā)展到什么程度。現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)革命的一個(gè)最大特點(diǎn)是發(fā)展速度極其迅速抡四，誰(shuí)也不知道明天會(huì)發(fā)生什么柜蜈，當(dāng)然也不能十分準(zhǔn)確的預(yù)知一個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展方向。即便如此指巡，筆者還是對(duì)這個(gè)領(lǐng)域有一些預(yù)測(cè)或期待（僅技術(shù)角度淑履，不涉及具體生物學(xué)研究）。
1）超大規(guī)模藻雪、超快速度數(shù)據(jù)采集和處理秘噪。和晶體學(xué)相比，冷凍電鏡的效率在某些方面已經(jīng)異常驚人勉耀。比如筆者近期與牛津大學(xué)王祥喜博士合作指煎，在幾個(gè)小時(shí)以?xún)?nèi)就可以拿到完整甲肝病毒原子結(jié)構(gòu)蹋偏，而此前王祥喜博士花費(fèi)近一年時(shí)間結(jié)晶才最終拿到原子結(jié)構(gòu)。但是科學(xué)技術(shù)發(fā)展是永無(wú)止境的……
但目前來(lái)說(shuō)至壤，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的巨大轉(zhuǎn)型必須建立在速度和效率的雙重前提下威始。這需要硬件、軟件以及其它交叉學(xué)科等多方面的共同發(fā)展像街。
除了生物學(xué)研究應(yīng)用黎棠，筆者一直致力于冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，最近在提高電鏡數(shù)據(jù)處理結(jié)果可靠性和分辨率前提下宅广，上千倍地提高了其中幾個(gè)環(huán)節(jié)葫掉，過(guò)去幾百到上千CPU小時(shí)的事情些举，現(xiàn)在幾分鐘到幾十分鐘就完成了跟狱。但是這只是部分環(huán)節(jié)，在其它方面依舊非常耗時(shí)户魏，整個(gè)技術(shù)的各個(gè)環(huán)節(jié)如何全面高效高速地完成還需要更多的優(yōu)秀人才參與驶臊。對(duì)硬件的發(fā)展方面筆者并不是很熟悉，預(yù)計(jì)在未來(lái)會(huì)出現(xiàn)超高速度的電子顯微鏡叼丑，大幅度提高電鏡原始數(shù)據(jù)的數(shù)量和質(zhì)量关翎。
2）大尺度、高分辨率鸠信、高動(dòng)態(tài)的生物大分子結(jié)構(gòu)解析纵寝。理論上，冷凍電鏡可像高清數(shù)碼攝像機(jī)拍電影一樣對(duì)生物大分子成像和重現(xiàn)其動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)星立，研究深層機(jī)理爽茴。就目前而言，這一方面在技術(shù)上遠(yuǎn)未成熟绰垂。大尺度室奏、高分辨率、高動(dòng)態(tài)這幾點(diǎn)拆解開(kāi)來(lái)劲装，每一個(gè)都不算太難胧沫，但是同時(shí)滿(mǎn)足這幾項(xiàng)需求幾乎成為不可能的事情。但是這是未來(lái)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方向占业，我們不僅僅要看簡(jiǎn)單的幾張靜態(tài)照片绒怨，我們還想看高清電影。
關(guān)于這一點(diǎn)谦疾，筆者需要強(qiáng)調(diào)一下結(jié)構(gòu)生物學(xué)和動(dòng)力學(xué)模擬的區(qū)別窖逗。結(jié)構(gòu)生物學(xué)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)目的是以實(shí)驗(yàn)手段完整復(fù)原自然狀態(tài)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，理解其中機(jī)理餐蔬，是從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)出發(fā)“重現(xiàn)大自然原貌”的過(guò)程碎紊，是完完全全可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果佑附。而動(dòng)力學(xué)模擬是從已有的理論或經(jīng)驗(yàn)性的物理學(xué)規(guī)律出發(fā)預(yù)測(cè)一個(gè)生物大分子的動(dòng)態(tài)特性，存在巨大的不確定性仗考，其結(jié)果可靠性較差音同。期待在未來(lái)的某個(gè)時(shí)刻，兩者會(huì)像上個(gè)世紀(jì)的理論物理和實(shí)驗(yàn)物理一樣完美地結(jié)合秃嗜，相互促進(jìn)权均。
大尺度復(fù)雜生物系統(tǒng)的高分辨率、動(dòng)態(tài)機(jī)理研究涉及諸多學(xué)科锅锨，不是冷凍電鏡一項(xiàng)技術(shù)就可以完成的叽赊，需要多學(xué)科科學(xué)家共同參與完成。
3）高分辨單分子及原位結(jié)構(gòu)研究必搞。目前的結(jié)構(gòu)生物學(xué)必指，無(wú)論晶體學(xué)、冷凍電鏡還是核磁共振主要還是在研究“群體”結(jié)構(gòu)恕洲。冷凍電鏡相對(duì)晶體學(xué)在這一方面已經(jīng)有了大幅度提高塔橡，可以通過(guò)分類(lèi)的方法研究群體結(jié)構(gòu)中的每一類(lèi)結(jié)構(gòu)。但實(shí)際上每個(gè)分子在時(shí)間和空間上除了共性霜第，也必然有特性葛家，如果一種方法強(qiáng)大到可以測(cè)得單個(gè)分子的高分辨率結(jié)構(gòu)，這必然導(dǎo)致巨大革命泌类，使得人們發(fā)現(xiàn)許許多多在群體結(jié)構(gòu)研究層次上無(wú)法發(fā)現(xiàn)也無(wú)法理解的大量規(guī)律癞谒。
注意這里強(qiáng)調(diào)的是單分子“高分辨率”結(jié)構(gòu)，而不僅僅是單分子結(jié)構(gòu)刃榨。單分子結(jié)構(gòu)我們目前可以使用比如冷凍斷層成像（cryoET）的手段獲得弹砚，但是分辨率非常低，在如此低分辨率情況下喇澡，別說(shuō)個(gè)體差異迅栅，很多群體結(jié)構(gòu)差異都值得嚴(yán)重質(zhì)疑∏缇粒或許冷凍電鏡技術(shù)若干年以后會(huì)實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)读存，或許永遠(yuǎn)都不可能，或許這個(gè)目標(biāo)被另外一個(gè)全新的技術(shù)徹底取代呕屎，冷凍電鏡從此退出歷史舞臺(tái)让簿。
冷凍電鏡：一個(gè)高度交叉的學(xué)科
冷凍電鏡領(lǐng)域一直是多學(xué)科高度交叉和相互促進(jìn)才誕生的一個(gè)奇跡。數(shù)學(xué)秀睛、物理尔当、化學(xué)、材料、計(jì)算機(jī)椭迎、軟件锐帜、機(jī)械及自動(dòng)化、精密儀器儀表等等缺一不可畜号，當(dāng)然最終的核心是生命科學(xué)（作者注：此處僅從結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度分析缴阎，并非泛指一般意義上生命科學(xué)是一切學(xué)科的核心）。生命科學(xué)提出問(wèn)題简软，其它所有學(xué)科相互結(jié)合產(chǎn)生更好的解決方案蛮拔。通過(guò)這些解決方案，發(fā)現(xiàn)更多神秘的生命現(xiàn)象痹升，從而提出新的問(wèn)題建炫，誕生新的技術(shù)。
舉個(gè)例子疼蛾，冷凍電鏡圖像信噪比極低肛跌，沒(méi)有科學(xué)家的雄心勃勃，沒(méi)有大批信號(hào)分析据过、圖像處理甚至數(shù)學(xué)家的參與是不可能完成這樣艱巨的任務(wù)惋砂。同時(shí)冷凍電鏡領(lǐng)域的一些發(fā)現(xiàn)或需求妒挎，也為其它領(lǐng)域的科學(xué)家提供靈感來(lái)源和新的研究思路绳锅。MRC-LMB作為現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)源地和近兩年來(lái)飛速發(fā)展的冷凍電鏡技術(shù)核心研究機(jī)構(gòu)，其一大特點(diǎn)就是多學(xué)科“零距離交叉”酝掩。從半個(gè)世紀(jì)前的DNA雙螺旋模型鳞芙、肌紅蛋白晶體結(jié)構(gòu)等到近兩年冷凍電鏡技術(shù)革命，一直將這一理念體現(xiàn)得淋漓盡致期虾。技術(shù)的發(fā)展和重大科學(xué)問(wèn)題的解決幾乎都是同時(shí)進(jìn)行的原朝，當(dāng)然科學(xué)問(wèn)題或應(yīng)用價(jià)值始終是核心和最終驅(qū)動(dòng)力，脫離科學(xué)和應(yīng)用需求的技術(shù)發(fā)展是沒(méi)有意義的镶苞。
另外一個(gè)比較具體的例子是筆者此前思考過(guò)的一個(gè)問(wèn)題喳坠。在電鏡領(lǐng)域出現(xiàn)直接電子探測(cè)設(shè)備之后，MRC-LMB的兩臺(tái)高端電鏡茂蚓，每天產(chǎn)生5到10T的數(shù)據(jù)量壕鹉，近期正在調(diào)試第三臺(tái)，也許不久的將來(lái)聋涨，超大數(shù)據(jù)晾浴、超快速度電鏡就會(huì)投入生產(chǎn)，這些將會(huì)導(dǎo)致全世界各個(gè)研究機(jī)構(gòu)普遍出現(xiàn)一個(gè)嚴(yán)重的技術(shù)問(wèn)題牍白，就是如何高效脊凰、無(wú)損、快速地進(jìn)行數(shù)據(jù)壓縮存儲(chǔ)和數(shù)據(jù)處理茂腥，當(dāng)然這里的無(wú)損是相對(duì)特定生物樣品和特定目標(biāo)分辨率而言狸涌。這或許會(huì)引起一些信號(hào)處理和圖像壓縮方面的研究人員的興趣切省。
隨著冷凍電鏡對(duì)生物大分子復(fù)合物高分辨率結(jié)構(gòu)研究趨于成熟，更加復(fù)雜的動(dòng)態(tài)機(jī)理研究是必然趨勢(shì)帕胆，這是冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展的一個(gè)潛在可能性数尿。但是復(fù)雜生物體系的深入研究需要解決一系列數(shù)學(xué)理論、物理惶楼、計(jì)算難題右蹦，有的可能甚至超出了這些學(xué)科目前的研究范疇。近些年比較現(xiàn)實(shí)可行的是通過(guò)冷凍電鏡手段歼捐，對(duì)特定蛋白復(fù)合物非隨機(jī)情況下的高分辨連續(xù)動(dòng)態(tài)構(gòu)象進(jìn)行分析何陆。筆者認(rèn)為，專(zhuān)業(yè)數(shù)學(xué)家的參與會(huì)大大加速冷凍電鏡技術(shù)在這些方面的發(fā)展豹储。
生命體高度復(fù)雜贷盲，充滿(mǎn)很多未知的和未被闡述清楚的規(guī)律，這里面有成千上萬(wàn)的生物大分子復(fù)合物剥扣，每一個(gè)復(fù)合物又與其它若干分子或復(fù)合物相互作用巩剖、相互影響，深入再深入地理解生命本質(zhì)一直都會(huì)是冷凍電鏡的重要方向钠怯。冷凍電鏡是強(qiáng)大的基礎(chǔ)研究手段佳魔，它通過(guò)解析高度復(fù)雜的生物大分子結(jié)構(gòu)，幫助人們更好地理解生命規(guī)律晦炊，從而影響生命科學(xué)相關(guān)的一切下游學(xué)科和技術(shù)鞠鲜，當(dāng)然也包括更好的發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)藥物、醫(yī)療診斷等具體應(yīng)用断国。我們期待在不久的將來(lái)贤姆，冷凍電鏡技術(shù)會(huì)對(duì)科學(xué)研究和社會(huì)發(fā)展等方方面面都產(chǎn)生巨大影響。
參考鏈接
MRC-LMB官方網(wǎng)站：
http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/
http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/achievements/lmb-nobel-prizes/
Aaron?Klug（首次創(chuàng)立電鏡三維重構(gòu)方法）
https://en.wikipedia.org/wiki/Aaron_Klug
《The?revolution?will?not?be?crystallized:?a?new?method?sweeps?through?structural?biology》
http://www.nature.com/news/the-revolution-will-not-be-crystallized-a-new-method-sweeps-through-structural-biology-1.18335
Method?of?the?Year?2015
http://www.nature.com/nmeth/journal/v13/n1/index.html#prim
饒毅：國(guó)產(chǎn)博士記錄??（介紹程亦凡博士的博文）
http://blog.sciencenet.cn/blog-2237-749393.html
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