2021.4.3
持續(xù)更新中遮晚。性昭。。
目的：從Illumina原始下機(jī)數(shù)據(jù)拼接細(xì)菌基因組草圖县遣。
軟件：FastQC糜颠、Cutadapt、Velvet萧求、SSPACE其兴、gapfiller
1. FastQC(v0.11.9) —— 質(zhì)控
fastqc <sequence_1.fastq.gz> <sequence_2.fastq.gz> -o <目錄名> -t 線程數(shù)
重要參數(shù)：
1. -o：輸出文件目錄（需要提前新建一個(gè)目錄）
2. -t：選擇程序運(yùn)行的線程數(shù)
3. -f：指定輸入文件格式
主要結(jié)果文件：
*.html
2. Cutadapt(v3.3) —— 過濾
cutadapt -a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA -A AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA
-o <sequence_filtered_1.fastq.gz> -p <sequence_filtered_2.fastq.gz>
-q 20,20 --max-n 0.1 -m 75 <sequence_1.fastq.gz> <sequence_2.fastq.gz>
我在另一臺(tái)計(jì)算機(jī)上安裝之后使用過程中遇到一些麻煩，好像是讀入文件的哪個(gè)模塊缺失夸政，暫時(shí)還未解決
重要參數(shù)
1. -a：paired-end測(cè)序文件中正向序列文件接頭序列（文件1）
2. -A：paired-end測(cè)序文件中反向序列文件接頭序列（文件2）
3. -o：文件1去接頭后的結(jié)果文件
4. -p：文件2去接頭后的結(jié)果文件
5. -q：序列兩端堿基質(zhì)量低于某一數(shù)值時(shí)被切除元旬，用,隔開，例如：-q 20,20。
6. -m：reads1和reads2中切除接頭后的序列長度最小值法绵，低于這個(gè)數(shù)值則去除，例如：-m 75酪碘。
7. --max-n：N堿基占比一定比例時(shí)被去除朋譬，例如--max-n 0.1，表示N堿基占read比例到10%時(shí)會(huì)被去除兴垦。
8：最后是兩個(gè)原始序列文件徙赢。
可選參數(shù)
1. -- pair-filter=(any|both)：any表示read1 和 read2任何一個(gè)檢測(cè)到接頭均舍棄；both表示 read1 和 read2 全部檢測(cè)到接頭才舍棄read1 和 read2探越。（默認(rèn)any）
2. -O ：默認(rèn)為3狡赐，即至少三個(gè)堿基配才認(rèn)為是adapter序列。
3. -e：最大錯(cuò)配比例钦幔，默認(rèn)是0.1枕屉。（解釋：cutadapt在一條read中檢測(cè)到20bp的接頭序列，那么允許該
20bp的接頭序列有2個(gè)堿基的錯(cuò)配）
3. Kmergenie —— 預(yù)測(cè)最佳kmer值和估計(jì)基因組大小
kmergenie <fq.list> -o <result> -s 10 -t 10
重要參數(shù)：
1. fq.list：包含需要查詢的文件鲤氢，一行一個(gè)文件名（文件所在的絕對(duì)路徑）
2. -o：結(jié)果輸出的前綴名
3. -l：系統(tǒng)考慮的最小k值（默認(rèn)：15）
4. -k：系統(tǒng)考慮的最大k值（默認(rèn)：121）
5. -s：從最小k值到最大k值搀擂，每次增加的值（默認(rèn)：10）
6. -t：線程數(shù)
我在另一臺(tái)計(jì)算機(jī)上安裝之后使用過程中遇到一些麻煩！原因還沒有弄清楚卷玉！
3. Velvet —— 拼接contigs
步驟一：利用velveth對(duì)數(shù)據(jù)構(gòu)建一個(gè)hash表
velveth <output> 111 -shortPaired -fastq -separate
<sequence_filtered_1.fastq.gz> <sequence_filtered_2.fastq.gz>
重要參數(shù)：
1. output：輸出文件目錄
2. 111：即hash_lenghth哨颂，用來設(shè)置k-mer的大小。也可以是31,97,2的形式相种，指分別拼接kmer從31到97威恼，依次增加2的序列（默認(rèn)：31）
3. -shortPaired：reads的類型。
4. -fastq：輸入文件的格式（默認(rèn)是fasta）寝并。
5. -separate：分開兩個(gè)文件讀入箫措。
步驟二：velvetg進(jìn)行序列拼接
velvetg <output> -exp_cov auto -cov_cutoff auto
重要參數(shù)：
1. <output>：velveth生成的結(jié)果目錄
2. -exp_cov：期望的kmer覆蓋度，設(shè)置成auto用于標(biāo)準(zhǔn)的基因組測(cè)序衬潦。該參數(shù)設(shè)置成auto后蒂破，-cov_cutoff也許設(shè)置成auto。
4. SSPACE —— 拼接scaffolds
4.1 下載安裝
1. 下載bowtie(或者bowtie2)
conda install bowtie2
2. 從github下載最新版本加壓縮進(jìn)入后進(jìn)入加壓縮目錄别渔。（最新的免費(fèi)版本是v2.1.1）
① 最新的版本可以用bwa直接處理壓縮包附迷，可惜作者并不是免費(fèi)提供的。
② 解壓縮后的SSPACE_Basic.pl即是主要的執(zhí)行命令
4.2 使用
步驟一：寫配置文件library.txt
#中間以空格符隔開
#1 2 3 4 5 6
#文庫 正向序列 反向序列 插入文庫大小 偏差 reas方向(pairend測(cè)序和matepaire不一樣)
lib1 FP822_filtered_R1.fastq FP822_filtered_R2.fastq 500 0.25 FR
步驟二：scaffold
perl SSPACE_Basic_v2.0.pl -l <library.txt> -s <velvet_contigs.fa> -T 20 -b standard_out
重要參數(shù)：
1. -l：后接配置文
2. -s：要連接的contig序列
3. -T：-T：線程數(shù)（默認(rèn)：1）
4. -b：輸出文件前綴名
可選參數(shù)：
① -m：利用reads對(duì)contig進(jìn)行衍生時(shí)哎媚，最小overlap的長度（默認(rèn)：32bp)
② -o：利用reads對(duì)contig進(jìn)行衍生時(shí)喇伯，最小reads覆蓋的數(shù)量（默認(rèn)：20）
③ -k：連接兩條contig連接時(shí)，最小支持reads對(duì)數(shù)（默認(rèn)：5對(duì)）
④ -a：連接兩條contig連接時(shí)拨与，最大連接的比率（默認(rèn)：0.7）
⑤ -n：連接兩條contig連接時(shí)稻据，最小需要的overlap長度（默認(rèn)：15bp）
⑥ -z：用于連接scaffold的最小contig長度（默認(rèn)：0）
⑦ -g：比對(duì)過程中，允許的gap數(shù)（默認(rèn)：0）
⑧-p：是否輸出dot文件用于圖形展示（默認(rèn)：0，不輸出）
5. GapFiller —— 拼接scaffolds
????由于無法獲得該軟件捻悯，因此補(bǔ)洞的時(shí)候選擇了其他的替代軟件：soapdenovo2-gapcloser匆赃。其配置文件的書寫方法總體同soapdenovo2，需要將asm_flags的參數(shù)設(shè)置為4即可今缚。
- 配置文件
max_rd_len=150
[LIB]
avg_ins=439
reverse_seq=0
asm_flags=4
rank=1
pair_num_cutoff=3
map_len=32
q1=FP822_R1.fastq.gz
q2=FP822_R2.fastq.gz
- 使用方法
GapCloser -a <scaffolds.fasta> -b <config_file> -o <gapcloser_scaffolds.fasta> -l 150 -t 10
重要參數(shù)：
-a：輸入scaffold文件
-b：輸入配置文件
-o：輸出文件名
-l：read的最大程度（默認(rèn)100）
-t：線程數(shù)（默認(rèn)1）
6. 結(jié)果
7. 總結(jié)
- 根據(jù)目前所獲得信息（拼接知識(shí)和軟件）算柳，該套流程拼接結(jié)果和公司較為接近。
- 影響最終拼接效果的因素有很多姓言，其中kmer取值較為關(guān)鍵瞬项。
- 如果有更好的軟件，后續(xù)會(huì)繼續(xù)更新何荚，也希望有高手指出不足之處囱淋。
