生信小課堂

影響因子：12.4

研究概述：
胃癌的發(fā)病率和死亡率分別位居惡性腫瘤的第五和第四（2002年數(shù)據(jù)）窒典，當(dāng)前主要的治療是手術(shù)結(jié)合放化療蟆炊，輔以靶向治療，但總體療效令人不甚滿(mǎn)意崇败。因此需要深入探索影響療效的關(guān)鍵分子以及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新療法盅称。近些年腫瘤免疫微環(huán)境（TME）被認(rèn)為與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，腫瘤巨噬細(xì)胞后室，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞缩膝，PD-1/PD-L1通路，MSI-H狀態(tài)等對(duì)TME的影響相繼被報(bào)道岸霹，但仍沒(méi)有準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)指標(biāo)來(lái)根據(jù)腫瘤免疫浸潤(rùn)情況挑選出最有可能從免疫治療中獲益的患者疾层，因此需要分析腫瘤免疫微環(huán)境的異質(zhì)性。組蛋白去乙豕北埽化家族（HDACs）在染色體結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)兩個(gè)重要生物學(xué)過(guò)程中具有重要作用痛黎，其中HDAC6，HDAC3等成員以及HDAC抑制劑已被報(bào)道能夠調(diào)節(jié)TME以及免疫治療應(yīng)答過(guò)程中的關(guān)鍵分子與通路刮吧，因此單個(gè)分子或者單一酶抑制劑難以精準(zhǔn)調(diào)控TME湖饱，需要系統(tǒng)分析HDACs家族的表達(dá)譜以及相關(guān)的免疫浸潤(rùn)情況從而為胃癌患者療法選擇以及預(yù)后評(píng)估提供理論基礎(chǔ)。在本研究中杀捻，作者從HDACs家族的18個(gè)成員的bulk轉(zhuǎn)錄組出發(fā)井厌，聯(lián)合4個(gè)GEO以及TCGA和ACRG胃癌隊(duì)列進(jìn)行了多組學(xué)的探索，接著進(jìn)行了兩次分型并從中獲取差異基因后構(gòu)建出HCS。隨后仅仆，基于HCS器赞，作者用自己的配對(duì)bulk轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了降維聚類(lèi)、細(xì)胞通訊兩個(gè)大模塊的分析墓拜，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵細(xì)胞群后進(jìn)一步對(duì)這些細(xì)胞簇進(jìn)行更細(xì)分的聚類(lèi)與細(xì)胞通訊分析并得出關(guān)鍵結(jié)論港柜。隨后，作者進(jìn)行了藥物敏感性分析咳榜，分析結(jié)果指向GPX4可能是低HCS患者的重要靶點(diǎn)并對(duì)此進(jìn)行了大篇幅的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證夏醉。總之贿衍，這篇文章做到了bulk和單細(xì)胞的五五開(kāi)授舟，做到了生信和實(shí)驗(yàn)五五開(kāi)救恨，工作量之大贸辈，值得學(xué)習(xí)！

本文生信部分本質(zhì)上是通過(guò)分型進(jìn)行分組肠槽，對(duì)比不同組的各種差異擎淤，然后進(jìn)行評(píng)分，比較分?jǐn)?shù)與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系秸仙。需要做類(lèi)似的生信分析歡迎交流嘴拢！

研究結(jié)果：

TCGA胃癌隊(duì)列的HDACs多組學(xué)景觀(guān)與基于HDACs表達(dá)譜的NMF分型

圖A展示了HDACs家族成員的胞內(nèi)定位。圖B是十條腫瘤相關(guān)通路的ssGSEA評(píng)分與TCGA中HDACs（不同顏色代表不同子家族）表達(dá)量的相關(guān)性寂纪，發(fā)現(xiàn)即使是同一子家族的HDACs與通路的相關(guān)性方向也不一致席吴。圖C是ssGSEA算法評(píng)估的不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平與TCGA中HDACs表達(dá)量的相關(guān)性，可見(jiàn)如未成熟DC細(xì)胞的浸潤(rùn)水平與HDACs表達(dá)量普遍負(fù)相關(guān)捞蛋。圖D展示了基于HDACs表達(dá)譜的三個(gè)NMF亞型與胃癌患者的生存密切相關(guān)孝冒。圖E是整合了GEO中不同胃癌隊(duì)列的KEGG富集結(jié)果熱圖，圖示的是limma包在亞型間有顯著差異的通路拟杉。圖F是亞型A和亞型C在CIBERSORT算法評(píng)估的不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的差異庄涡，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)亞型在重要免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平上有顯著差異。

ACRG胃癌隊(duì)列中再分型并計(jì)算HDAC得分（HDS）與分層

圖A展示了ACRG隊(duì)列（作為驗(yàn)證隊(duì)列）中HDACs在三個(gè)亞型間的差異表達(dá)情況搬设，顯著的PCA分型結(jié)果以及KM曲線(xiàn)穴店，初步說(shuō)明基于HDACs的NMF分型具有較強(qiáng)的泛化能力。圖B中Venn圖展示了三個(gè)亞型兩兩間的差異表達(dá)基因取交集拿穴，之后基于交集基因同樣進(jìn)行NMF分型泣洞，熱圖結(jié)合臨床信息對(duì)其可視化，獲取HDAC特征A基因集和B基因集默色，分別是單因素COX回歸鑒定的保護(hù)基因和危險(xiǎn)基因球凰。圖C兩張柱狀圖是對(duì)基因集A和B的GO富集通路，發(fā)現(xiàn)兩群基因截然不同。圖D的桑基圖說(shuō)明基于HDACs的聚類(lèi)和基于交集基因的聚類(lèi)具有很高的一致性悍及，也說(shuō)明了潛在的生物學(xué)機(jī)制一致性奈搜。圖E的KM曲線(xiàn)說(shuō)明基于差異基因的分型能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者生存，圖F和G發(fā)現(xiàn)兩種分型中各亞型的HDS（基于兩兩亞型差異分析昧绣，單因素COX回歸，Boruta算法降維捶闸，主成分分析計(jì)算而來(lái)）具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異夜畴。這部分基于自己驗(yàn)證隊(duì)列的多分型分析說(shuō)明HDACs家族的表達(dá)譜能夠定義胃癌患者不同的生物學(xué)狀態(tài)，并基于此計(jì)算出了HDS并將患者分為高低HDS組删壮。

關(guān)聯(lián)HDS與臨床特征和多組學(xué)特征

圖A說(shuō)明TCGA隊(duì)列中高低HDS分組能夠鑒別患者不同生存狀態(tài)贪绘，腫瘤分級(jí)以及微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)。圖B和C將ACRG隊(duì)列的HDS與各種臨床信息相關(guān)聯(lián)央碟，在給出隊(duì)列基線(xiàn)信息的同時(shí)說(shuō)明了HDS具有的強(qiáng)大預(yù)測(cè)能力税灌，圖D分別是基于OS和RFS的單因素和多因素cox回歸，發(fā)現(xiàn)HDS是穩(wěn)健的保護(hù)因素亿虽。圖F是不同胃癌隊(duì)列中HDS與抗原提呈相關(guān)基因菱涤，共刺激分子以及共抑制分子之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)相關(guān)性普遍較強(qiáng)并且分子與HDS的相關(guān)性在不同隊(duì)列中具有很高的一致性洛勉。

高HDS可能指向胃癌的“熱腫瘤”表型

圖A氣泡圖展示了不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平與HDS的相關(guān)性粘秆，發(fā)現(xiàn)HDS與免疫殺傷細(xì)胞如CD4+, CD8+ T細(xì)胞，NKT細(xì)胞收毫，Th17細(xì)胞呈現(xiàn)一致的正相關(guān)攻走，與免疫抑制細(xì)胞如M2, MDSC，pDC以及基質(zhì)細(xì)胞等此再。圖B熱圖說(shuō)明HDS與血管生成基因普遍負(fù)相關(guān)昔搂，即高HDS患者血管生成不活躍。公共隊(duì)列的結(jié)果表明HDS得分越高抗腫瘤免疫越強(qiáng)引润，作者進(jìn)一步用自測(cè)的121名胃癌患者隊(duì)列PKUPH驗(yàn)證這一初步推論巩趁，圖D先說(shuō)明HDS能夠預(yù)測(cè)PKUPH隊(duì)列患者的生存，圖E相關(guān)性熱圖一方面說(shuō)明不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度之間存在相關(guān)性淳附，另一方面與HDS的相關(guān)性與在公共隊(duì)列中的發(fā)現(xiàn)基本一致议慰。圖F免疫熒光發(fā)現(xiàn)高HDS腫瘤樣本的CD8與PD-L1表達(dá)水平明顯高于低HDS腫瘤樣本，這與前面的分析結(jié)果完全一致奴曙。

HDS能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)胃癌患者免疫治療療效

圖A是使用TIDE算法基于表達(dá)矩陣鑒別出responder和non-responder之后别凹，用submap衡量反應(yīng)分組與HDS分組的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異洽糟，即HDS可預(yù)測(cè)抗PD1治療反應(yīng)炉菲。圖B是PRJEB40416免疫治療隊(duì)列反應(yīng)分組與HDS及風(fēng)險(xiǎn)分組的關(guān)聯(lián)堕战，但兩組之間的HDS得分沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖C是HDS和CPS以及兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)PRJEB40416隊(duì)列免疫治療反應(yīng)的ROC曲線(xiàn)拍霜，兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率能夠達(dá)到0.881嘱丢，高于單獨(dú)預(yù)測(cè)。圖D是HDS及其他指標(biāo)在另一免疫治療隊(duì)列PRJEB25780的預(yù)測(cè)情況祠饺，可以發(fā)現(xiàn)HDS聯(lián)合MSI聯(lián)合CPS能夠達(dá)到0.96的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性越驻。圖E展示了PRJEB25780中各反應(yīng)表型的HDS評(píng)分，結(jié)果同樣與上述分析一致道偷。圖G為預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)構(gòu)建了諾莫圖缀旁，可用于預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序探索高低HDS患者的TME特征

這部分開(kāi)始轉(zhuǎn)向單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的分析勺鸦，這篇文章亮點(diǎn)之一是使用了自己的bulk轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的配對(duì)測(cè)序結(jié)果并巍，使得深入探索高低HDS組之間的差異成為可能。圖A是配對(duì)測(cè)序的示意圖换途，圖B是20個(gè)樣本的tSNE聚類(lèi)圖懊渡，發(fā)現(xiàn)了9個(gè)細(xì)胞群并用熱圖展示了各細(xì)胞群的marker基因。圖C展示的是20個(gè)配對(duì)樣本每個(gè)患者基于bulk轉(zhuǎn)錄組計(jì)算的HDS以及風(fēng)險(xiǎn)分組怀跛，兩個(gè)tSNE聚類(lèi)圖分別展示了高HDS組和低HDS組的細(xì)胞群分布距贷，圖D用柱狀圖量化了9個(gè)細(xì)胞簇中高低HDS兩組的比例柄冲，發(fā)現(xiàn)兩組患者的TME浸潤(rùn)程度有較大差別吻谋。圖E是對(duì)圖D進(jìn)行的兩組檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的正是關(guān)鍵的CD4+T細(xì)胞现横，CD8+T細(xì)胞以及NK細(xì)胞漓拾，這些殺傷細(xì)胞在高HDS組中比例更高。圖F在表達(dá)層面上用免疫熒光驗(yàn)證了高HDS腫瘤組織中CD4以及CD8熒光信號(hào)比低HDS腫瘤組織更強(qiáng)戒祠。

內(nèi)皮細(xì)胞和纖維母細(xì)胞可能通過(guò)MIF信號(hào)通路抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤(rùn)

圖A展示兩組細(xì)胞通訊的交互數(shù)量以及交互強(qiáng)度骇两，發(fā)現(xiàn)低HDS組有更高的交互強(qiáng)度，圖B環(huán)形圖與熱圖同樣說(shuō)明低HDS組的細(xì)胞間具有更強(qiáng)的交互并且具體到時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞與CD4+T姜盈，CD8+T細(xì)胞以及NK細(xì)胞之間通信強(qiáng)度高低千。接下來(lái)又將這兩種細(xì)胞在高低HDS組中做了tSNE降維聚類(lèi)，圖C表示鑒定出2個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞群和6個(gè)成纖維細(xì)胞群及其marker基因馏颂，并基于marker基因?qū)?xì)胞群進(jìn)行命名示血。圖D與圖A基本平行，柱狀圖展示了每個(gè)細(xì)胞群中高低HDS來(lái)源細(xì)胞的比例救拉。因?yàn)殛P(guān)注的是能夠殺傷腫瘤細(xì)胞的CD4+T难审，CD8+T細(xì)胞以及NK細(xì)胞，所以對(duì)這三類(lèi)細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行了降維聚類(lèi)亿絮，鑒定出22個(gè)細(xì)胞群后與內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的8個(gè)細(xì)胞群進(jìn)行細(xì)胞通訊告喊，挑選出與三類(lèi)細(xì)胞通信數(shù)量及強(qiáng)度均最高的SFRP2+, MYH11+, CD69+成纖維細(xì)胞麸拄，CD234+內(nèi)皮細(xì)胞。圖F氣泡圖是對(duì)這個(gè)亞群和T細(xì)胞及NK細(xì)胞之間通訊涉及到的通路的探索黔姜，發(fā)現(xiàn)MIF信號(hào)通路在低HDS組中顯著富集拢切，作者推斷挑選出來(lái)的3個(gè)成纖維細(xì)胞群和一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞群可能通過(guò)MIF信號(hào)與三種效應(yīng)細(xì)胞溝通，從而降低了它們?cè)诘虷CS樣本中的浸潤(rùn)水平秆吵。

低HDS組患者中CCL17陽(yáng)性漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞可能通過(guò)MIF信號(hào)通路抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤(rùn)

除了上一張圖B中關(guān)注的內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞失球，髓系細(xì)胞與T細(xì)胞核NK細(xì)胞的溝通也較強(qiáng)，于是作者進(jìn)一步將髓系細(xì)胞劃分為12個(gè)細(xì)胞群（圖A）并根據(jù)標(biāo)記基因?qū)?xì)胞類(lèi)型進(jìn)行注釋?zhuān)▓DB）帮毁，圖C氣泡圖展示了每個(gè)細(xì)胞群的TOP5 marker基因实苞。圖D是兩組患者各自12群髓系細(xì)胞與T細(xì)胞以及NK細(xì)胞的通訊情況，發(fā)現(xiàn)以CCL17+為標(biāo)記基因之一的pDC細(xì)胞在高低HCS組中均與T細(xì)胞和NK細(xì)胞有較強(qiáng)的通訊烈疚。隨后黔牵，與上一張圖F思路一致，圖E發(fā)現(xiàn)CCL17+pDC細(xì)胞與T細(xì)胞和NK細(xì)胞之間的通訊同樣設(shè)計(jì)MIF通路爷肝。圖F探究MIF信號(hào)通路關(guān)鍵受體在上述細(xì)胞及高低HCS組中的表達(dá)差異猾浦，但結(jié)果是陰性的。得到CCL17+pDC細(xì)胞群后灯抛，作者對(duì)這一群細(xì)胞進(jìn)行了KEGG通路富集金赦，發(fā)現(xiàn)其功能主要富集在T細(xì)胞分化以及抗原提呈等經(jīng)典抗腫瘤免疫通路中（圖G），ACRG隊(duì)列中CCL17+pDC細(xì)胞的富集得分與HDS負(fù)相關(guān)（圖H）对嚼，但不能對(duì)生存分層（圖I）夹抗。基于以上分析纵竖，作者提出：在低HDS腫瘤中漠烧，CCL17+pDC可能通過(guò)激活MIF通路與T細(xì)胞和NK細(xì)胞頻繁交流從而阻斷后者的浸潤(rùn)水平。

在低HDS患者中GPX4可能是腫瘤細(xì)胞的重要靶點(diǎn)

圖A展示了MIF通路4-IPP抑制劑的用法靡砌，圖B體外實(shí)驗(yàn)說(shuō)明抑制MIF通路能夠減小腫瘤體積已脓，圖C說(shuō)明抑制MIF通路后CD8+和CD4+T細(xì)胞數(shù)量上升，圖D-G流式分析結(jié)果表明抑制MIF通路后細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞數(shù)量上升通殃。

接下來(lái)做了藥物敏感性分析度液，圖A是藥敏分析的流程圖，用的是CTRP2和PRISM的藥敏信息以及CCLE的表達(dá)信息画舌，主要篩選條件是高低HCS組間AUC有差異以及AUC與HCS的相關(guān)性堕担。圖B1在CTRP2數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)低HCS胃癌細(xì)胞系可能對(duì)三種GPX抑制劑敏感，圖B2在PRISM數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)低HCS胃癌細(xì)胞系可能對(duì)兩種藥物敏感骗炉。為進(jìn)一步探究GPX4抑制劑對(duì)低HDS腫瘤患者敏感的機(jī)制照宝，作者在CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)中選取了5個(gè)胃癌細(xì)胞系（圖B3），計(jì)算其HDS后發(fā)現(xiàn)AGS細(xì)胞系的HDS最低句葵，因此選取AGS細(xì)胞系用不同siRNA沉默GPX4厕鹃，選取沉默作用最強(qiáng)的siGPX4-2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖B4）兢仰。為進(jìn)一步探究GPX4抑制劑對(duì)高HDS患者的高敏感機(jī)制，作者在ACRG和TCGA隊(duì)列中探索18種HDACs的表達(dá)剂碴，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)HDASs在兩組間差異表達(dá)（圖C）把将，隨后作者敲除GPX4驗(yàn)證了公共數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)的HDACs差異（圖D），敲除后通路富集在代謝和免疫（圖E）忆矛，在沉默GPX4后察蹲，作者還發(fā)現(xiàn)敲除GPX4后共刺激與共抑制分子的表達(dá)發(fā)生了變化（圖F）。最后催训，作者在ACRG隊(duì)列中基于GPX4表達(dá)分組發(fā)現(xiàn)免疫浸潤(rùn)及細(xì)胞因子表達(dá)有顯著差異（圖G）洽议。

GPX4敲除可能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)并提升抗PD-L1療效

這部分用MFC胃癌細(xì)胞系探索沉默GPX4后對(duì)腫瘤表型的影響。圖A的RT-PCR結(jié)果以及WB結(jié)果表明成功沉默了GPX4表達(dá)漫拭，且沉默組發(fā)生了更多的腫瘤細(xì)胞調(diào)往（圖B）亚兄。圖C的遷移侵襲實(shí)驗(yàn)說(shuō)明沉默GPX4能夠降低胃癌細(xì)胞的遷移侵襲能力，采驻，圖D的Edu實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默GPX4能夠降低腫瘤細(xì)胞增殖率审胚，圖E的小鼠皮下異種移植模型說(shuō)明沉默GPX4能夠減少腫瘤體積并與更高的存活率有關(guān)。

接下來(lái)作者繼續(xù)探索沉默GPX4對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響礼旅。沉默GPX4后膳叨，CD8+細(xì)胞水平降低（圖A），CD8+T細(xì)胞水平上升（圖B）痘系，CD8+T細(xì)胞分泌的IFN-γ增加（圖C）菲嘴。圖D示意將小鼠脾臟T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比碎浇，與沉默GPX4的腫瘤細(xì)胞系MFC共培養(yǎng)的CD8+T細(xì)胞毒性更強(qiáng)（圖E）临谱。隨后作者進(jìn)一步探索了沉默GPX4所致CD8+T細(xì)胞增強(qiáng)的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)沉默GPX4后PD-L1的mRNA和蛋白水平都顯著下降（圖F）奴璃，沉默組小鼠皮下腫瘤移植物的PD-L1 mRNA表達(dá)也要高于未沉默組（圖G）。最后城豁，作者發(fā)現(xiàn)敲除GPX4與抗PD-L1聯(lián)合治療可提高胃癌免疫治療效果（圖H）苟穆。

研究總結(jié)： 這篇文章根據(jù)胃癌 HDAC 的表達(dá)特征構(gòu)建了一個(gè) HDS 模型，該模型用于評(píng)估TME特征和預(yù)測(cè)免疫療法療效唱星，可以準(zhǔn)確反映胃癌的亞型特征雳旅，并為胃癌的 TME 提供定量指標(biāo)。高 HDS 表示腫瘤 "熱"间聊，可從免疫療法中獲益攒盈。抑制TME中的MIF信號(hào)通路和腫瘤細(xì)胞中GPX4的表達(dá)可能是胃癌冷腫瘤協(xié)同免疫療法的重要策略。