我想分享一篇今年四月份發(fā)表在 《Nature biotechnology》 上的文章介劫，題目是 “Gene signature extraction and cell identity recognition at the single-cell level with Cell-ID”钞它，翻譯出來是 “基于Cell ID的單細(xì)胞水平基因指紋特征提取和細(xì)胞身份識別方法”撒穷。
我們知道單細(xì)胞RNA測序技術(shù)（scRNA-seq）的應(yīng)用已經(jīng)越來越廣泛蓝纲。在研究人類器官組織和細(xì)胞的類型上讶坯，scRNA-seq 是一個很好的技術(shù)解決方案丰辣。目前比較有代表性的研究項目包括：人類細(xì)胞圖譜項目盛杰、美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）主導(dǎo)的人類生物分子圖譜計劃和 LifeTime 項目等焰扳。
單細(xì)胞研究的一個重要目的是揭示細(xì)胞之間復(fù)雜且豐富的異質(zhì)性特征倦零。但這個領(lǐng)域一直以來都有一個挑戰(zhàn)误续，那就是 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的維度和噪聲都比較高，這導(dǎo)致對細(xì)胞異質(zhì)性的研究變得十分復(fù)雜扫茅，這個問題在很大程度上也制約了細(xì)胞多樣性的研究蹋嵌。
一般來說降低數(shù)據(jù)維度可以提高信噪比，也就是用少量但是顯著的特征描述細(xì)胞诞帐。目前在這方面用得最廣的是PCA欣尼、ICA、tSNE和UMAP停蕉。但這些方法本質(zhì)上都是基于聚類來實(shí)現(xiàn)的愕鼓，它們在計算細(xì)胞特征的過程中尋找的是細(xì)胞之間的共性差異，因此這些方法所揭示的異質(zhì)性實(shí)際上停留在細(xì)胞亞群這個較粗的顆粒度上慧起，而不是精確到單個細(xì)胞的水平菇晃。
但對于細(xì)胞轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的詳盡研究實(shí)際上需要我們對每一個細(xì)胞的基因表達(dá)特征都進(jìn)行可靠的統(tǒng)計和分析。所以蚓挤，如何能夠可靠地表征每一個細(xì)胞的基因特征就成為了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中一個尚未被完整解決的科學(xué)問題磺送。
這也是 NBT 這篇文章所要解決的問題。這篇文章的作者來自法國巴黎大學(xué)灿意，他們提出了一個稱為 Cell-ID 的無聚類多元統(tǒng)計方法估灿。這個方法可以從單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)中將每個細(xì)胞的基因特征有效地提取出來，并且還能夠橫跨不同的數(shù)據(jù)集對不同的細(xì)胞類型進(jìn)行注釋和匹配缤剧，發(fā)現(xiàn)未知或罕見的細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)馅袁。
從原理來說，Cell-ID 背后所依據(jù)的方法是統(tǒng)計學(xué)中的多重對應(yīng)分析法（Multiple correspondence analysis, 簡稱 MCA）荒辕，這是一種變量統(tǒng)計分析方法汗销，它可以用來分析多個高緯度變量（比如基因表達(dá)量）之間的關(guān)聯(lián)以及和多個低緯度觀察值（比如細(xì)胞）之間的對應(yīng)關(guān)系。
MCA方法經(jīng)常被應(yīng)用到社會科學(xué)領(lǐng)域的研究之中抵窒，用來調(diào)查測試對象對不同問題的態(tài)度一致性弛针，法國和日本對這個方法的使用尤為普遍，可能也是這個原因法國巴黎大學(xué)的研究人員率先將這個方法移植到了單細(xì)胞基因指紋特征的提取上李皇。
MCA 本質(zhì)上也是一個針對多個分類變量的降維方法削茁，就如同針對定量變量的主成分分析法一樣，最終目的是讓同個類別的對象將緊靠在一起疙赠，而不同類別的對象遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開（但不同之處在于MCA除了降維之外付材，還可以檢測多變量之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系）。
但要注意 MCA 僅適用于從定性變量（也就是“分類變量”）中得出統(tǒng)計結(jié)論圃阳，所以在應(yīng)用 MCA 之前需要先將定量變量轉(zhuǎn)化為分類變量厌衔，例如將連續(xù)型變量標(biāo)準(zhǔn)化之后取它們的統(tǒng)計分位數(shù)來作為分類變量。當(dāng)數(shù)據(jù)集完全表示為分類變量之后捍岳，就可以構(gòu)建相關(guān)的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行 MCA 分析了富寿。
文章這里是通過線性變換的方式將各個細(xì)胞的基因表達(dá)量轉(zhuǎn)化到0和1的范圍之內(nèi)睬隶，這樣就可以在 MCA 的數(shù)學(xué)框架之下對細(xì)胞的特征進(jìn)行定量分析了，這一點(diǎn)也是這篇文章中一個較為巧妙的處理方法页徐，下面的圖1是 Cell-ID 的原理概述苏潜。
從圖1.a可以看出，Cell-ID 通過 MCA 實(shí)現(xiàn)了基因表達(dá)矩陣的降維变勇，圖中細(xì)胞（黃色圈圈）和基因（黑色“+”）都投影到一個共同的正交空間中恤左，這個圖也叫做 MCA 雙標(biāo)圖（MCA biplot）。在這樣的正交空間中搀绣，基因離細(xì)胞越近飞袋，那么就代表它對某個細(xì)胞的特異性越高。因此链患，可以在 MCA 空間中巧鸭，將細(xì)胞上的基因與該細(xì)胞的距離作排序，排序靠前的基因就可以作為這個細(xì)胞的基因特征麻捻，或者稱作該細(xì)胞的基因指紋纲仍，看作是這個細(xì)胞的一個獨(dú)特身份證。同時贸毕，每個細(xì)胞的基因特征本身也是一個很有價值的數(shù)據(jù)郑叠，所以還可以單獨(dú)將它們提取出來構(gòu)成一個單細(xì)胞基因特征數(shù)據(jù)集用于進(jìn)行下游分析，比如圖1b中的功能研究等明棍。
那么關(guān)于 Cell-ID 的原理概述就到此為止了锻拘，當(dāng)然具體的數(shù)學(xué)細(xì)節(jié)我在這里無法展開，因?yàn)樵摬糠值募?xì)節(jié)對我來說也還有不清楚的地方击蹲，還需要做更多的數(shù)學(xué)演繹才行，當(dāng)然這其中最重要的就是 MCA 的原理（在很多多元統(tǒng)計學(xué)的書本中有該原理的數(shù)學(xué)描述）婉宰。
評估 Cell-ID 的有效性
接下來要對 Cell-ID 方法的有效性進(jìn)行綜合評估歌豺，這個評估的方法和結(jié)果貫穿全文也是文章的一個重點(diǎn)。
研究人員首先模擬生成了 100 個 scRNA-seq 數(shù)據(jù)心包，然后在這個數(shù)據(jù)集上分析基于MCA 降維的細(xì)胞和基因表達(dá)的一致性类咧。
這個一致性評估從三個層面來進(jìn)行：
- 通過計算 Spearman 相關(guān)性系數(shù)的方法，分別評估 MCA 方法和常用的 PCA 方法降維之后前10個主成分的結(jié)果相關(guān)性（如 Supplementary Fig 1）蟹腾，可以看到各個PC之間的相關(guān)性都很高痕惋，接近于 1；
通過近鄰法進(jìn)行對比娃殖。具體來說是對由 MCA 方法所獲得的每個細(xì)胞中的基因排列和 MCA 空間中相鄰的另外50個細(xì)胞進(jìn)行對比值戳。主要是比較他們的基因表達(dá)量是否一致，對比的結(jié)果也在 Supplymentary Fig1a.b 中展示出來了炉爆，可以看出一致性情況也是很好的堕虹，也就是說彼此相鄰的細(xì)胞卧晓，它們的基因特征也相似；
進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)基于 MCA 得到的細(xì)胞基因特征信息即使是在發(fā)生高dropout現(xiàn)象的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集里也依然有很好的魯棒性赴捞。
這里我補(bǔ)充解釋一下什么是“Dropout現(xiàn)象”：Dropout 現(xiàn)象是 scRNA-seq 中常發(fā)生的一個事件逼裆，意思是基因表達(dá)信息漏測。原因是很多在表達(dá)的基因赦政，由于每個細(xì)胞中 mRNA 序列起始量較低或者測序技術(shù)的原因而沒有被檢測到胜宇，這部分基因的表達(dá)信息就被漏掉了。dropout 現(xiàn)象所導(dǎo)致的數(shù)據(jù)丟失恢着，會影響下游的數(shù)據(jù)分析桐愉，如何解決這個問題也是單細(xì)胞組學(xué)所面臨的一個挑戰(zhàn)。 https://www.linkresearcher.com/theses/b57bbc38-da8c-463b-8c91-4d56c3101ac4
除了使用模擬數(shù)據(jù)之外然评，研究人員接下來使用兩組獨(dú)立的人血單核細(xì)胞對 Cell-ID 的有效性做更進(jìn)一步的評估仅财，這兩組細(xì)胞分別是：（1）基于 CITE-seq 方案得到的臍血單核細(xì)胞（CBMCs）和（2）通過 REAP-seq 方案得到的外周血單核細(xì)胞，這兩個方案都是通過檢測單個細(xì)胞的蛋白標(biāo)記物水平對單個細(xì)胞的特征進(jìn)行了注釋碗淌。
這相當(dāng)于是通過實(shí)驗(yàn)檢測的方法盏求，得到了一個單細(xì)胞類型特征的參考數(shù)據(jù)。
通過對比分析之后亿眠，可以發(fā)現(xiàn) Cell-ID 的基因指紋特征在對應(yīng)類型細(xì)胞的基因上都有顯著的富集情況（圖 2.a）碎罚，這個富集可以說明 Cell-ID 得到的細(xì)胞基因特征和真實(shí)結(jié)果是具有高度一致性。
圖2. Cell-ID通過預(yù)先建立的標(biāo)記列表識別人類CBMCs細(xì)胞類型
從具體數(shù)字上來說纳像，這兩個數(shù)據(jù)集中 Cell-ID 的識別精確度（Precision）分別達(dá)到了 87% 和 90%荆烈，召回率（Recall）達(dá)到了 84% 和 73%。這個結(jié)果想要告訴我們的是竟趾，文章所提出的 Cell-ID 能夠很好地提取每個細(xì)胞的基因指紋并用來識別不同的細(xì)胞類型憔购。
除此之外，Cell-ID 甚至還能識別正在分化的細(xì)胞亞型岔帽，例如文章圖 2c,d 所示的那樣玫鸟，Cell-ID 捕獲到了造血干細(xì)胞的分化亞型，而且即使是罕見的細(xì)胞狀態(tài)也可以被 Cell-ID 識別出來犀勒。
同類細(xì)胞的可重復(fù)性識別評估
緊接著屎飘，研究人員進(jìn)一步評估了 Cell-ID 對同一組織不同批次 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集中識別相同細(xì)胞類型的能力。如文章圖3所示（如下）贾费，主要分析了來自多個不同供體钦购、不同測序平臺所產(chǎn)生的人類胰島和人類以及小鼠氣道上皮細(xì)胞的數(shù)據(jù)集。結(jié)果發(fā)現(xiàn)褂萧，Cell-ID 的整體性能和有效性與已經(jīng)發(fā)表的方法相當(dāng)押桃。精確度和召回率都很高，其中精確度大于 92%箱玷，召回率也高于 75%怨规。
圖3. Cell-ID對同一或不同來源組織、種內(nèi)和種間的scRNA-seq數(shù)據(jù)集的細(xì)胞匹配表現(xiàn)
跨組織的細(xì)胞類型識別能力評估
然后波丰，評估 Cell-ID 在不同組織來源的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中識別同一種細(xì)胞類型的能力壳坪。
文章還是用氣道上皮細(xì)胞作為例子（圖3 展示了這個過程）￡蹋基于在氣道上皮細(xì)胞中獲得的無偏基因指紋特征爽蝴，Cell-ID 識別出了腸上皮中的刷狀/族狀細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞和杯狀細(xì)胞纫骑，而且精度高達(dá)90%蝎亚、召回率達(dá)到73%。對比之后發(fā)現(xiàn)先馆，這個精度已經(jīng)優(yōu)于已經(jīng)發(fā)表過的方法（圖3c发框、d可以查看更加具體的對比結(jié)果）。
另外煤墙，他們還使用 Cell-ID 對兩個獨(dú)立的嗅上皮細(xì)胞數(shù)據(jù)集做細(xì)胞類型的掃描和識別梅惯，同時對比了來自氣道和腸道上皮的族狀細(xì)胞特征，結(jié)果還識別出了推測中罕見的仿野、未分類的SCCs細(xì)胞铣减，即孤立化學(xué)感覺細(xì)胞(如圖3e、f所示)脚作。
跨測序平臺的評估
這是對 Cell-ID 的最后一項評估葫哗，評測了它在不同的單細(xì)胞組學(xué)平臺上的表現(xiàn)，同時驗(yàn)證它在基因指紋特征識別上的可重復(fù)性（文章圖4展示了這個具體的過程）球涛。這個評估所用到的數(shù)據(jù)主要來自于雄性小鼠細(xì)胞圖譜中的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)和小鼠 ATAC 圖譜中單細(xì)胞 ATAC-seq 數(shù)據(jù)劣针。分析結(jié)果也顯示，Cell-ID 對來源于 scRNA-seq 和 ATAC-seq 的數(shù)據(jù)得出的細(xì)胞類型匹配度都很好亿扁，F(xiàn)1 分值也都比較高酿秸，并且要優(yōu)于當(dāng)前已發(fā)表的其他方法。
圖4. Cell-ID對來源于不同單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)的獨(dú)立數(shù)據(jù)集上細(xì)胞間匹配能力的評估
所以魏烫，綜合來說，這篇文章所提出的 Cell-ID 可以非常量化地提取并注釋細(xì)胞的基因特征用于表征不同的細(xì)胞類型肝箱，并且能夠在不同的供體哄褒、器官組織、物種和單細(xì)胞測序平臺中得到有效的重復(fù)和驗(yàn)證煌张。這樣的一個方法可以改善我們在單細(xì)胞水平的生物學(xué)方面的研究和解釋力呐赡，可以更好地發(fā)現(xiàn)以前未被表征出來的罕見細(xì)胞類型或者細(xì)胞狀態(tài)，而且這個方法還為跨組織骏融、跨生物體的細(xì)胞類型研究以及系統(tǒng)多組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)链嘀，意義非凡萌狂。
啟發(fā)
讀了這一篇文章之后，我想最后再談一點(diǎn)它帶給我的一個啟示怀泊。
實(shí)際上茫藏，這篇文章所用到的統(tǒng)計學(xué)方法并不算很新穎，它只是將一個在其他學(xué)科中用得比較廣的方法復(fù)用到單細(xì)胞組學(xué)中來霹琼，并沒有創(chuàng)造一種全新的統(tǒng)計學(xué)算法务傲，但是卻在單細(xì)胞組學(xué)領(lǐng)域取得了很好的效果，可見微創(chuàng)新同樣是獲得重要科研成果的有效手段枣申，甚至還是一個高效的手段售葡，未必都得好高騖遠(yuǎn)，還是要因時制宜忠藤，當(dāng)然他們的先發(fā)優(yōu)勢也是這里面一個重要的加分項挟伙。
文章提出的 Cell-ID 從原理上來說，我覺得還可以應(yīng)用到腸道菌群基因組的研究之中模孩，可以用類似于 Cell-ID 的思路設(shè)計一個 Meta-ID 來對不同的腸道菌群進(jìn)行特征表達(dá)和識別尖阔，這樣一來應(yīng)該也能夠進(jìn)一步提升當(dāng)前的腸道菌群多組學(xué)研究。
參考文獻(xiàn)
Cortal A, Martignetti L, Six E, Rausell A. Gene signature extraction and cell identity recognition at the single-cell level with Cell-ID [published online ahead of print, 2021 Apr 29].Nat Biotechnol.2021;10.1038/s41587-021-00896-6.
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首發(fā)于個人公眾號：helixminer（堿基礦工）
