瞬轉(zhuǎn)目標蛋白DNA，使其在細胞中瞬時高表達浙巫，在熒光顯微鏡下觀察是否會形成聚合物顆粒。
1 蛋白表達質(zhì)粒構(gòu)建
（1）將自己的目標蛋白們的CDS區(qū)的DNA序列導入primer 5 看里面存在哪些酶切位點刷后，將沒有出現(xiàn)的酶切位點的畴，作為引物末端，而引物中間序列則為目標蛋白DNA序列的前19位尝胆，與后19位丧裁。
首先在NCBI protein中輸入蛋白名稱，找到蛋白序列后導出fasta CDS序列含衔，
例：
點擊：send to
出現(xiàn)txt文檔煎娇，就是蛋白的編碼區(qū)的全部序列。
2 設計primer
將質(zhì)粒序列抱慌，目標蛋白序列同時導入primer5然后查看質(zhì)粒中含有的內(nèi)切酶位點及其目標蛋白全序列中沒有的位點作為引物設計的位點逊桦。
常見的額內(nèi)切酶識別位點：
當你設計好引物，添加上了內(nèi)切酶識別序列抑进，下一步或許是添加保護堿基了强经，可以參考：
所以VDR的primer為：
F:前面黑色字體為保護堿基+Cla1序列，后面19個堿基為VDR序列的前19個堿基寺渗。
R：前面黑色字體為保護堿基+Kpn1的序列匿情，后面19個堿基為VDR最后19個堿基的反義鏈兰迫。
反向互補鏈網(wǎng)站：https://novopro.cn/tools/rev_comp.html
引物設計的目的是將目標片段擴增出來以便與載體連接。
（2）PCR擴增：
以人***細胞cDNA為模板炬称，PCR擴增目的基因汁果，在引物兩端分別引入上述選好的酶切位點，1%瓊脂糖凝膠回收目的基因DNA條帶玲躯。
（3）載體和目標片段的限制性酶切：
質(zhì)粒載體CMV和目的基因PCR產(chǎn)物的上述兩種酶雙酶切据德，酶切反應在37℃水浴反應2h；1%瓊脂糖凝膠電泳分別回收質(zhì)粒酶切大片段和目的基因酶切片段跷车。
（4）連接轉(zhuǎn)化：
質(zhì)粒酶切回收大片段與目的基因連接棘利，連接反應在16℃反應12小時。取10ul連接產(chǎn)物與100ul DH5a感受態(tài)細菌混勻后冰浴30min朽缴，42℃熱激90s善玫，立即置冰上放置5min,加入預熱至室溫的700ul LB培養(yǎng)基， 37℃恒溫搖床培養(yǎng)50min密强，吸取 200ul的菌液茅郎，用移液器混勻后均勻涂布于含100ug/ml Ampicillin抗性的LB平板上， 37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜或渤。
（5）挑取克隆提質(zhì)粒驗證：
挑取5個單菌落接種于含5ml系冗，100μg/ml Ampicillin抗性的LB培養(yǎng)液中，300rpm薪鹦，37℃恒溫搖床培養(yǎng)過夜毕谴，對過夜的菌液進行擴增，選擇陽性菌液距芬，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，再進行測序驗證循帐。
