Author: Marijori A. Matzke and Rebecca A. Mosher
Journal: Nature Review Genetics
doi: 10.1038/nrg3683
link: RNA-directed DNA methylation: an epigenetic pathway of increasing complexity

Abstract

Abstract | RNA-directed DNA methylation (RdDM) is the major small RNA-mediated epigenetic pathway in plants. RdDM requires a specialized transcriptional machinery that comprises two plant-specific RNA polymerases — Pol IV and Pol V — and a growing number of accessory proteins, the functions of which in the RdDM mechanism are only partially understood. Recent work has revealed variations in the canonical RdDM pathway and identified factors that recruit Pol IV and Pol V to specific target sequences. RdDM, which transcriptionally represses a subset of transposons and genes, is implicated in pathogen defence, stress responses and reproduction, as well as in interallelic and intercellular communication.

RNA指導(dǎo)的DNA甲基化是植物中小RNA參與的表觀遺傳調(diào)控的主要方式空繁。RdDM的實(shí)現(xiàn)需要由兩個(gè)植物特有的兩個(gè)RNA聚合酶Pol IV and Pol V以及大量的輔助蛋白構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的參與邑商，這些輔助蛋白的功能在RdDM途徑中的作用還沒有完全搞明白。最近的工作揭示了經(jīng)典的RdDM途徑的變化绑改，同時(shí)鑒定出可以將Pol IV and Pol V募集到目標(biāo)基因上的一些因子天吓。RdDM可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制轉(zhuǎn)座子，基因（表達(dá)），參與到了植物抗病替废，脅迫應(yīng)答，再生以及與等位基因間（interallelic）和細(xì)胞間的通信泊柬。

小RNA調(diào)控基因表達(dá)

Overview

RNA interference (RNAi) is an umbrella term that describes gene silencing phenomena triggered by small RNAs.

• (post-transcription gene silencing, PTGS)在細(xì)胞質(zhì)中椎镣，siRNA通過在轉(zhuǎn)錄后加工過程中對(duì)complementary mRNAs的降解和抑制來沉默基因表達(dá).
• (transcriptional gene silencing, TGS)在細(xì)胞核內(nèi)，小RNA通過對(duì)基因組同源區(qū)域的表觀遺傳修飾例如DNA胞嘧啶甲基化和組蛋白甲基化來導(dǎo)致基因沉默兽赁。
• 分為兩組：小干擾RNA small interfering RNAs,siRNA 和PIWI-interacting RNAs状答， piRNAs,其中siRNAs廣泛存在于動(dòng)物植物真菌中，但是piRNAs只存在于后生動(dòng)物中刀崖，在植物和真菌中不存在惊科，在植物匯中由小RNA介導(dǎo)的DNA甲基化是小RNA參與到表觀遺傳主要的方式。

RdDM

In plants, the major siRNA-mediated epigenetic pathway is RNA-directed DNA methylation (RdDM), which is the subject of this Review. Initially detected in plants that were infected with RNA pathogens , RdDM was later shown to require siRNAs and core RNAi proteins.

RdDM通路是植物特有的亮钦，因?yàn)檎麄€(gè)通路圍繞著兩個(gè)植物特有的與RNA聚合酶II相關(guān)的酶馆截，分別是聚合酶IV和聚合酶V。

RNA pol IV 和Pol V詳細(xì)介紹

• DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾或悲。在植物中孙咪，DNA甲基化發(fā)生于CG，CHG和CHH序列巡语。DNA甲基化在這些序列的建立都依賴于一條RNA介導(dǎo)的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation翎蹈，RdDM)途徑。RNA聚合酶Pol IV和Pol V在RdDM途徑中分別負(fù)責(zé)產(chǎn)生小干擾RNA（small　interfering　RNAs男公，siRNAs）和長(zhǎng)非編碼RNA（Long Intergenic Noncoding RNAs荤堪， IGN RNAs）。siRNA和AGO4結(jié)合并與IGN RNA互補(bǔ)配對(duì)枢赔，招募甲基轉(zhuǎn)移酶DRM2（Domain Rearranged Methyltransferase 2）至靶標(biāo)位點(diǎn)建立DNA甲基化澄阳。
• Box1 RNA polymerases IV and V
  RNA聚合酶有三大類： RNA聚合酶 I → 核糖體大亞基； RNA聚合酶 II → mRNA前體踏拜； RNA聚合酶III → tRNA和5S rRNA碎赢， Pol IV和Pol V與 Pol II 同源，是植物特有的速梗，參與到RdDM肮塞。首先PolII PolIV和PolV均有12個(gè)亞基襟齿，大部分都是共有的，除了PolII的nuclear RNA polymerase B, NRPB; Pol IV的 NRPD以及Pol V的NRPE枕赵。其中比較大的亞基是NRPD1和NRPE1猜欺，分別于NRPD2及NRPE2構(gòu)成了催化核心，與polII 的NRPB1不同拷窜，在催化中心和碳末端CTDs存在保守氨基酸序列的代換和缺失开皿，這可能就是他們參與到RdDM機(jī)制的原因，在NRPB1的CTDs區(qū)域有一段7肽重復(fù)篮昧，但是在NRPD1和NRPE1中這些重復(fù)是不存在的赋荆，在這些7肽重復(fù)中包含了一個(gè)基序（motif），這個(gè)基序通常出現(xiàn)在被稱作有缺陷的葉綠體和葉片的蛋白中DeCL,事實(shí)上懊昨，DeCL蛋白通常參與到rRNA的生理過程糠睡，但是NRPD1和NRPE1中的CTDs的功能未知。NRPE1中延長(zhǎng)的CTD同時(shí)包含了Trp-Gly或者Gly-Trp的重復(fù)序列疚颊，這些重復(fù)序列是AGO蛋白的結(jié)合區(qū)域，可以和AGO4結(jié)合信认，而這個(gè)結(jié)構(gòu)決定了Pol V參與到siRNA介導(dǎo)的從頭甲基化材义。
  在Pol II中NRPB1和nRPB2亞基會(huì)結(jié)合NRPB5和NRPB9B會(huì)形成一個(gè)鉗型結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄的時(shí)候可以抓住DNA嫁赏，Pol V的NRPE5和NRPE9B的功能表明這或許是適應(yīng)新的轉(zhuǎn)錄模板的特殊結(jié)構(gòu)特征或者染色質(zhì)修飾其掂。在體外實(shí)驗(yàn)中，Pol IV和PolV可以根據(jù)一個(gè)由RNA-DNA共同構(gòu)成的模板來轉(zhuǎn)錄一個(gè)有RNA引物引發(fā)的轉(zhuǎn)錄本潦蝇；此外款熬，Pol IV還可以轉(zhuǎn)錄出一段RNA-RNA模板。盡管體外Pol IV和pol V的模板已知攘乒，但是一些有一些與他們傳統(tǒng)功能不同的贤牛，例如作為非常規(guī)的內(nèi)切酶或者外切酶，或者是一個(gè)染色質(zhì)外的模板應(yīng)該被考慮则酝。與Pol II相似殉簸，Pol IV和Pol V需要一些因子將他們從細(xì)胞質(zhì)帶入細(xì)胞核中，酵母同源IWR1已經(jīng)被證明可以將Pol II運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核沽讹，在RdDM缺陷型突變體中般卑，Pol IV 和Pol V的入核的方式與Pol II的方式相似。

過程簡(jiǎn)述

首先由Pol IV 轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)的雙鏈RNA（long dsRNAs）爽雄，然后在DICER_LIKE3, (DCL3)作用下加工成siRNAs蝠检，然后輸出到細(xì)胞質(zhì)中；接下來挚瘟，這些siRNAs的一條鏈裝載到AGO4叹谁，然后再運(yùn)回到細(xì)胞核饲梭，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則這些siRNA會(huì)靶定Pol V轉(zhuǎn)錄的新生轉(zhuǎn)錄骨架上（nascent scaffold transcripts..真的布吉島怎么翻譯，但可以確定是一段非編碼RNA本慕？）最終排拷，這個(gè)復(fù)合體會(huì)招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)所有包含CG，CHG和CHH（H代表A锅尘，C或者T）序列位點(diǎn)的甲基化监氢。最終結(jié)果會(huì)導(dǎo)致由Pol V轉(zhuǎn)錄的基因座上的轉(zhuǎn)錄本的沉默，特別是在轉(zhuǎn)座子位置或者DNA重復(fù)序列處藤违。這種機(jī)制與裂殖酵母中的TGS截然相反.

裂殖酵母的TGS中的RNA Pol II 同時(shí)轉(zhuǎn)錄出siRNAs的前體和吸附siRNAs的支架RNA（scaffold RNA）浪腐，然后再招募沉默感受復(fù)合體（silencing effector complex），與誘導(dǎo)DNA甲基化方面相比顿乒，這些沉默感受符合體通過對(duì)組蛋白3第9位上的賴氨酸進(jìn)行甲基化（H3K9me）實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄沉默和染色體異質(zhì)化议街。通常發(fā)生在pericentromeric repeats區(qū)域，或者一些發(fā)育調(diào)節(jié)基因developmentally regulated genes及逆轉(zhuǎn)座子retrotransposons部位璧榄。

Canonical RdDM pathway mechanisms

RdDM.jpg

Pol IV dependent siRNA biogensis

Pol VI缺陷突變體證明超過90%的24nt-siRNAs來自Pol VI特漩，而這些24nt-siRNAs會(huì)引起甲基化事件。

1. Pol VI結(jié)合到TE和重復(fù)序列上的機(jī)制尚不完全清楚骨杂； 首先SAWADEE HOMEODOMAIN HOMOLOGUE 1 (SHH1)會(huì)招募Pol VI涂身， SHH會(huì)通過串聯(lián)的Tudor-like fold結(jié)合到甲基化的H3K9和沒有甲基化的H3K4。
2. 盡管沒有在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Pol IV的轉(zhuǎn)錄本搓蚪，但是可以推斷出Pol IV可以在他的target基因座上轉(zhuǎn)錄出單鏈RNAs蛤售。該ssRNA會(huì)被RNA-dependent RNA polymerase, RDR2復(fù)制形成dsRNAs。
3. The chromatin remodeller CLASSY 1 (CLSY1)也參與到該過程妒潭。
4. DCL3（dicer）將合成的dsRNAs加工為24nt-siRNAs,然后經(jīng)過3‘-OH的甲基化后裝載在AGO4悴能，該過程是由HEN1完成的。

Tips : AGO4還存在其他分支雳灾，比如部分冗余的AGO6漠酿，以及在再生組織中特異表達(dá)的AGO9

Pol V-mediated de novo methylation

• 三磷酸化的或者5'端被封住缺少poly（A）尾的Pol V的轉(zhuǎn)錄本被認(rèn)為可以提供一個(gè)支架RNA和siRNAs互作，并且招募其他沉默因子佑女。與Pol IV一樣记靡，具體的機(jī)制尚不清楚，與之結(jié)合的DNA共有序列也沒有被發(fā)現(xiàn)团驱；但很多ChIP-seq的結(jié)果顯示大部分Pol V被定位在胞嘧啶甲基化的轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列上摸吠，同時(shí)發(fā)現(xiàn)有24nt-siRNAs的存在。所以說明Pol V介導(dǎo)的RdDM應(yīng)該發(fā)生在這些區(qū)域嚎花。
• Pol V 介導(dǎo)的RdDM通常發(fā)生在常染色質(zhì)區(qū)域寸痢，特別是小的 “年輕” 的基因間區(qū)轉(zhuǎn)座子，或者存在于啟動(dòng)子區(qū)域紊选，外顯子啼止，內(nèi)含子區(qū)域的重復(fù)序列道逗。RdDM靶標(biāo)的位置與前面預(yù)測(cè)的PolIV PolV和PolII推測(cè)的一致，位于常染色質(zhì)主要的基因轉(zhuǎn)錄區(qū)域献烦。此外滓窍，Pol V在基因啟動(dòng)子區(qū)域的富集也說明了它繼承了Pol II在基因上有的偏好性。
• RdDM似乎在某種程度上不會(huì)發(fā)生在富含大轉(zhuǎn)座子的近著絲粒端的異染色質(zhì)區(qū)域巩那。相反吏夯，該區(qū)域的修飾（H3K9me and DNA甲基化），更傾向于一種siRNA獨(dú)立的方式并且依賴于染色質(zhì)重塑蛋白（chromatin remodeller DECREASED DNA METHYLATION1, DDM1）即横、DNA5端胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT1）噪生，class enzyme 甲基轉(zhuǎn)移酶（MET1，也叫DMT1）东囚，還有植物特異甲基轉(zhuǎn)移酶（CMT2）和（CMT3）跺嗽。
• SUVH2、SUVH9和SUVR2是SU（var）組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶家族的成員页藻，它們有助于將Pol V招募到一些靶序列中桨嫁。suvh2和suvh9不能催化組蛋白甲基化，但它們可以通過其SRA（SET and RING-associated）結(jié)構(gòu)域與甲基化的DNA結(jié)合份帐，從而有助于polV與染色質(zhì)的相互作用平臺(tái)瞧甩，染色質(zhì)包含一些預(yù)先存在的甲基化。PolV的轉(zhuǎn)錄與染色體的結(jié)合是在DDR復(fù)合體協(xié)助下完成的弥鹦。DDR復(fù)合體的成員:CLSY1-related putative chromatin remodeller DEFECTIVE IN RNA_DIRCTED DNA METHYLATION1(DRD1);DEFECTIVE IN MERISTEM SILENCING3（DMS3），DMS3是一個(gè)維持染色體構(gòu)像的鉸鏈蛋白爷辙；還有一個(gè)在RdDM通路中起到多種作用的小的植物特異蛋白：RNA-DIRCTED DNA METHYLATION1（RDM1）彬坏。
• Pol V 與NRPE1互作來招募AGO4蛋白，他們都含有AGO hook motif膝晾，這個(gè)基序就是與AGO栓始。PolV的motif位于C-端特殊的大亞基上，KTF1則是一個(gè)疑似的包含AGO hook motif的延伸因子血当。在Pol V介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄中幻赚，結(jié)合在AGO4上的siRNA會(huì)和PolV新轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄本根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，然后招募結(jié)構(gòu)重排甲基轉(zhuǎn)移酶2（DRM2）進(jìn)而對(duì)基因組同源區(qū)域的DNA進(jìn)行從頭甲基化臊旭，RDM1在招募DRM2的過程中起到關(guān)鍵作用落恼，因?yàn)樗俏ㄒ灰粋€(gè)被證明和AGO4和DRM2都能互作的蛋白，同時(shí)他還可以結(jié)合單鏈DNA离熏。RDM1在RdDM機(jī)制中可能還會(huì)扮演更多的角色佳谦。
• INVOLVED IN DE NOVO2（IDN2）
  IDN2是一個(gè)雙鏈RNA結(jié)合蛋白，和SUPPRESSOR OF GENE SILENCING 3滋戳，SGS3有關(guān)钻蔑，同時(shí)IDN2與PTGS也有關(guān)啥刻。 IDN2可以和兩個(gè)冗余的旁系同源產(chǎn)物（redundant paralogues）IDP1和IDP2形成復(fù)合體。IDN2-IDP復(fù)合體可以穩(wěn)定siRNAs和PolV支架RNAs結(jié)合的穩(wěn)定性咪笑，同時(shí)還可以通過和SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合體的互作來改變核小體定位可帽，從而加速RdDM機(jī)制的完成。

Interplay with chromatin features

組蛋白修飾

大約70%的RdDM的target幾乎都被H3K9me修飾過窗怒，這樣可以形成一個(gè)DNA甲基化的反饋循環(huán)來加強(qiáng)基因沉默,比如SUVH4（kryptonite）SUVH5和SUVH6催化H3K9me映跟，與CMT3催化的非CG-甲基化緊密相關(guān)，然而CMT3在染色體上結(jié)合的位點(diǎn)是H3K9me兜粘，因此建立一個(gè)自我加強(qiáng)的loop可以長(zhǎng)期保持表觀修飾申窘。
一些RdDM的target需要一些可以去除激活標(biāo)記的組蛋白修飾酶來維持DNA甲基化和促進(jìn)H3K9的甲基化，這些激活標(biāo)記包括乙蹩字幔化剃法，H3K4me和H2B泛素化等。HDA6與MET1結(jié)合來維持CG甲基化并且通過乙趼酚ィ化組蛋白來維持H3K9me贷洲。Jumonji C-type histone demethylase JUMONJI14（JMJ14）脫甲基酶以及兩個(gè)相關(guān)的組蛋白脫甲基酶LYSINE-SPECIFIC HISTONE DEMETHYLASE 1(LDL1)和LDL2一起維持DRM2指導(dǎo)的DNA甲基化，可能是通過去除靶標(biāo)位置的H3K4me晋柱。對(duì)于非CG甲基化及靶標(biāo)位置H3K9me的維持需要H2B的去泛素化优构。

高階染色質(zhì)結(jié)構(gòu)

首先兩個(gè)MORC-型ATPases在RdDM通路中起到重要作用，在擬南芥中雁竞，MORC6作為ATPase將DMS3變?yōu)镾MCHD1钦椭，這個(gè)蛋白是個(gè)cohesin-like蛋白，在大鼠中會(huì)導(dǎo)致X染色體的去激活碑诉。MORC1和MORC6缺失植物突變體表現(xiàn)出輕微的DNA甲基化和組蛋白修飾抑制盡管在靶標(biāo)位點(diǎn)失去了對(duì)轉(zhuǎn)錄組的沉默彪腔，這表明他們的作用應(yīng)該是導(dǎo)致染色質(zhì)凝結(jié)，有研究支持了這個(gè)說法进栽，一項(xiàng)研究表明這些突變體在著絲粒周圍的異染色質(zhì)表現(xiàn)出去凝結(jié)化德挣。