期刊預打樣

開發(fā)腦靶向肽基MMP-9抑制納米顆粒，用于治療MMP-9活性升高的腦疾病伪冰。

Yamir Islam, Khalid Aneesa, Stefano Pluchino, Muttuswamy Sivakumaran, Meritxell Teixidò, Andrew Leach, Amos A. Fatokun, James Downing, Christopher Coxon, Touraj Ehtezazi蹦渣。

皮伊: S0022-3549(20)30354-3 多伊:
https://doi.org/10.1016/j.xphs.2020.0 6.021 參考資料: 1998年
要出現(xiàn)在: 藥學雜志
收到日期:2020年4月20日 修訂日期: 102020年6月 接受日期:2020年6月23日
請引用這篇文章為:IslamY哄芜，AneesaK，PluchinoS柬唯，SivakumaranM认臊，TeixidoM，LeachA锄奢，F(xiàn)atokunAA失晴， DowningJ剧腻，CoxonC，EhtezaziT涂屁，開發(fā)基于MMP-9抑制納米粒子的腦靶向肽治療腦疾病與MMP-9活性升高书在， 藥學雜志(2020年)，DOI:胯陋。https://doi.org/10.1016/j.xphs.2020.06.021
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?2020年由Elsevier公司代表美國藥劑師協(xié)會出版。

開發(fā)腦靶向肽基MMP-9抑制納米顆粒丈屹，用于治療MMP-9活性升高的腦疾病

Yamir Islam调俘，1 Khalid Aneesa，1 Stefano Pluchino旺垒，2 Muttuswamy Sivakumaran彩库，3 Meritxell Teixido，4 安德魯·萊奇先蒋，1骇钦，b Amos A。 法托昆竞漾，1 詹姆斯·唐寧眯搭，1 Christopher Coxon，1业岁，a TourajEhtezazi鳞仙，1*

1利物浦約翰摩爾大學藥學和生物分子科學學院，利物浦叨襟，L33AF，英國 2臨床神經(jīng)科學系幔荒，CliffordAllbutt建筑-劍橋生物科學校園和NIHR生物醫(yī)學研究中心糊闽，劍橋大學梳玫，

Hills路，CB20HA劍橋右犹，英國提澎。 3海姆科，彼得堡市醫(yī)院念链，伊迪絲卡維爾校園盼忌，布雷頓門彼得堡， PE39GZ掂墓，彼得堡谦纱，英國。

4生物醫(yī)學研究所(IRB巴塞羅那)君编，巴塞羅那科學技術研究所(BIST)跨嘉，Baldiri Reixac10，巴塞 羅那08028吃嘿，西班牙祠乃。

a目前地址:愛丁堡赫里奧特瓦特大學工程和物理科學學院化學科學研究所，EH144AS

b現(xiàn)住址:英國曼徹斯特大學藥學院 *相關作者:t.ehtezazi@ljmu.ac.uk

摘要

腦基質金屬蛋白酶9 (MMP-9)的潛在和活性水平在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腦損傷中升高兑燥，導致神經(jīng)系統(tǒng)損傷和臨床結果差亮瓷。本研究旨在開發(fā)具有穿越血腦屏障(BBB)和抑制MMP-9能力的肽基納米顆粒。

合成了3個含腦靶向配體(HAIYPRH或CKAPETALC)與MMP-9抑制肽(CTTHWGFTLC)結合的兩親性肽段(HAIYPRH或CKAPETALC)降瞳，這些肽段在N-末端由甘氨酸(spacer)連接嘱支，并與膽固醇結合。采用19F-NMR測定MMP-9抑制率力崇。用乳酸脫氫酶(LDH)測定細胞毒性斗塘，用/不用胎牛血清進行透析研究。采用體外模型評價納米顆粒通過血腦屏障的能力亮靴。

兩親性肽(膽固醇- gggctthwgftlchaiyprh)形成納米顆粒
(平均尺寸為202.8 nm)具有跨越BBB模型的能力馍盟。MMP-9抑制
-6 -1納米顆粒對細胞無毒，可將4.5×10 s的kobs降低至MMP-9活性
完全抑制茧吊。透析研究表明贞岭，納米顆粒在40倍的極端稀釋下不會分解，但會被血清酶逐漸水解搓侄。

綜上所述瞄桨，抑制MMP-9的納米顆粒降低了MMP-9的活性，且具有可接受的血清穩(wěn)定性讶踪、最小的細胞毒性和通過體外血腦屏障模型的能力芯侥。
關鍵詞:MMP-9抑制劑、納米顆粒、腦給藥柱查、血腦屏障廓俭。

1. 介紹

基質金屬蛋白酶(MMPs)屬于metzincin家族。¹在人類中唉工，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了23種不同的基質金屬蛋白酶²研乒，它們被分為溶解型基質金屬蛋白酶和膜結合型基質金屬蛋白酶³×芟酰基質金屬蛋白酶可分為膠原酶雹熬、明膠酶、溶酶和母系溶酶⁴谣膳。MMPs共同代謝細胞外基質竿报。^{1，3参歹，5}

基質金屬蛋白酶9 (MMP-9)或明膠酶B是MMPs家族中的一員仰楚。MMP-9不僅代謝變性膠原⁶，而且分解各種膠原犬庇，激活和修飾細胞因子和趨化因子⁷僧界。MMP-9在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中表達。MMP-9在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如創(chuàng)傷性腦損傷⁸臭挽、和多發(fā)性硬化癥(MS)中表達升高⁹;其高水平被認為與不良預后有關捂襟。⁸Kumari等2011年研究表明，與db/+小鼠相比欢峰，db/db小鼠的同側半球中MMP-9的蛋白水解活性顯著增加葬荷，這增加了db/db小鼠發(fā)生梗死的幾率。¹⁰ MMP-9的表達與卒中的嚴重程度和不良預后相關纽帖，推薦臨床試驗作為拮抗MMP-9的藥物宠漩。¹¹

各種各樣的努力已經(jīng)開發(fā)了抑制MMP-9部分或全部。例如懊直，Nyormoi等人2003報道了一種具有抗腫瘤活性的MMP-9抑制因子(化合物5a)扒吁。此外，他們還報道了化合物5a并沒有直接作用于mitochondia室囊，但它通過配體-受體相互作用和caspase 8的激活表現(xiàn)出抗腫瘤活性¹²雕崩。另一個例子是，選擇性MMP-9抑制劑外消形的ND-336比becaplermin具有更高的愈合能力融撞，因為MMP-9促進了糖尿病足潰瘍的損傷作用¹³盼铁。一些MMP-9抑制劑已經(jīng)被報道，如GS-5745,¹⁴和AQU-118, ¹⁵但仍然需要鑒定一種具有阿片活性和較少毒性的抑制劑尝偎。為了達到這個目標饶火，MMP-9-siRNA被結合到量子上點的尺寸為15納米。目的是下調MMP-9在腦2中的表達微血管內皮細胞。¹⁶利用磁性平臺引導納米顆粒(NPs)進入大腦肤寝，將內源性基質金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1表面吸附在直徑為10 nm的磁性NPs上牧挣。在靜磁體作用下，NPs通過人體外血腦屏障(BBB)模型醒陆。¹⁷

在另一項研究中，我們開發(fā)了加載TIMP-1的聚乳酸-乙醇酸(PLGA) NPs來增強TIMP-1到大腦的傳遞裆针。NPs包覆聚山梨酯80 (PS80)刨摩，靜脈注射后穿透血腦屏障。¹⁸另一方面世吨，在另一項工作中澡刹，PLGA NPs (260nm)被PS80包裹，PS80含有-胡蘿卜素(減少器官中的氧化應激)耘婚。經(jīng)靜脈給藥后罢浇，這些NPs大部分積累在肺而不是大腦中(肺中2000 nmol/g，而大腦中0.2 nmol/g)沐祷。¹⁹本研究表明NPs應飾以腦靶向配體以治療腦疾病嚷闭。²⁰此外，Chen等人發(fā)現(xiàn)赖临，具有WPFYGTP表位的相關腺病毒(AAV)靶向大腦的效率是肝臟的35倍胞锰。有趣的是，帶有野生型小鼠腦微血管表位的AAVs對粘多糖病VII型小鼠腦無效兢榨。²⁰因此嗅榕，腦靶向配體可能適用于某些疾病，但不適用于其他疾病吵聪。因此凌那，腦靶向配體的選擇應與腦疾病相關。盡管上述方法是抑制腦疾病中MMP-9的有效方法吟逝，但需要通過靜脈注射特異性靶向大腦的納米顆粒來抑制MMP-9幾個小時帽蝶，但這些納米顆粒會被大腦/系統(tǒng)降解。這是因為澎办，人類研究表明嘲碱，對MMP-9抑制的有效治療窗口期是創(chuàng)傷性腦損傷后72小時。²¹一般認為局蚀，MMP-9等MMP-9在腦缺血早期具有有害作用麦锯，但對腦血流重建和血管生成有促進作用。^22-25

具有MMP-9抑制特性的二甲胺四環(huán)素²⁶已被用于治療中風的臨床試驗并取得了成功琅绅。²⁷然而扶欣，由于需要高劑量(10 mg/kg)，而且藥物的毒性對一些病人來說是致命的。²⁷最近的另一項臨床試驗表明料祠，對患者使用二甲胺四環(huán)素(200mg /day) 6個月可以防止從臨床孤立脫髓鞘綜合征轉變?yōu)槎喟l(fā)性硬化的風險骆捧。²⁸然而，二甲胺四環(huán)素的副作用(皮疹髓绽、頭暈和牙齒變色)在接受二甲胺四環(huán)素治療的患者中很常見敛苇，并且在某些情況下會導致退出試驗。²⁸這進一步表明了使用腦靶向給藥系統(tǒng)(如納米顆了撑唬或納米載體)以最小化藥物副作用的必要性枫攀。給選擇性MMP-9抑制劑(SB 3CT)改善長期的神經(jīng)行為在小鼠模型的創(chuàng)傷性腦損傷后腹腔內給藥。²⁹SB 3CT及其代謝物ρ-哦3 ct快速吸附和分發(fā)給大腦,然而,²⁹SB 3CT展品水溶性差,可能阻止其使用在臨床試驗中發(fā)現(xiàn)以來在2000株茶。³⁰因此,顯然需要大腦針對MMP-9抑制劑以最小的副作用,低成本和可伸縮性来涨。

本研究受到Koivunen, E.等人1999年工作的啟發(fā)，他們發(fā)現(xiàn)合成的肽CTTHWGFTLC(環(huán)二硫鍵)是mmp -9,的有效抑制劑启盛，³¹盡管已有其他MMP-9抑制肽的報道蹦掐。^32-34此外，CTTHWGFTLC是一種水溶性肽³¹僵闯，肽段較短卧抗，在大規(guī)模生產(chǎn)中具有優(yōu)勢。本研究旨在合成自組裝形成NPs的兩親性肽鳖粟，結合MMP-9抑制肽颗味，具有穿越血腦屏障的能力，用于治療神經(jīng)退行性疾病和腦損傷牺弹。本研究開發(fā)了含有腦靶向肽序列(HAIYPRH) [HAI peptide]的NPs浦马，但不適用于特定的腦疾病(圖1)。我們進行了體外實驗张漂，以評估NPs抑制MMP-9酶的效果以及這些NPs的細胞毒性晶默。

本研究采用hCMEC/D3細胞系建立靜態(tài)體外血腦屏障模型。^{35航攒，36}兩親性肽曾被開發(fā)用于腦靶向磺陡，^37，38但并未用于腦疾病如卒中或ms的治療漠畜。本研究證實了含有MMP-9抑制肽的腦靶向NPs能夠降低MMP-9活性并穿越血腦屏障币他。

2. 材料和方法

2.1材料

所有L-Fmoc氨基酸、Oxyma和ProTide?樹脂均來自CEM(白金漢憔狞，英國)蝴悉。N, N ' -Diisopropylcarbodiimide (DIC)衰琐、哌啶祭示、膽甾醇氯甲酸酯(瑞士法郎),三氟乙酸(組織),triisopropylsilane (TIPS),乙腈,甲酸和N, N -二異丙基乙胺(DIPEA) trizma基礎(三),氯化鈉,Brij35, N - (3 - Aminopropyl)甲基丙烯酰胺鹽酸鹽(APMA)和纖維素透析管與分子量截止10000年來自Sigma-Aldrich(英國多塞特郡)。Fmoc-L-4-氟苯丙氨酸來自Fluorochem?(Hadfield, UK)缴阎。二甲基甲酰胺(DMF)、1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚(PAN)和乙醚來自Acros Organics?(拉夫堡庆杜，英國)射众。MMP-9重組人蛋白、His標簽(10327H08H5)晃财、Pierce LDH細胞毒性檢測試劑盒和二水合氯化鈣(CaCl₂)均來自ThermoFisher Scientific?(Paisley, UK)叨橱。hCMEC/D3細胞系和補充(endogrol - ls補充劑、rh EGF断盛、l -谷氨酰胺雏逾、氫化可的松半胱氨酸、硫酸肝素郑临、抗壞血酸和胎牛血清)的endogrol - mv試劑盒培養(yǎng)基購自美國馬薩諸塞州Merck Millipore公司。使用的通道號為1-11號屑宠，批號為3130216厢洞。碳涂層銅網(wǎng)格來自Agar Scientific Ltd (Stansted, UK)。分子量為70 kDa的fitc -右旋糖酐購自Sigma-Aldrich(英國多塞特)典奉。聚對苯二甲酸乙二醇酯0.4um插入物(Sarstedt, Leicester, UK)由Sarstedt公司獲得躺翻。

2.2.方法

2.2.1.固相肽合成(SPPS)

使用CEM Liberty Blue?自動微波輔助肽合成器合成肽。³⁹簡單來說卫玖，將147毫克Rink Amide ProTide樹脂(負載容量0.61 mmol/g)轉移到一個反應容器中公你，并在DMF中膨脹。典型的Fmoc脫保護要求20%哌啶在DMF中在90℃持續(xù)90秒假瞬。用1 M的DIC溶液和Oxyma溶液分別作為激活劑和偶聯(lián)劑陕靠。用0.2 M的氨基酸溶液在DMF中合成。除半胱氨酸(Cys)在50℃偶聯(lián)和精氨酸(Arg)在75℃偶聯(lián)外脱茉，氨基酸在90℃偶聯(lián)剪芥。

2.2.2.液相色譜-質譜(LC/MS)分析

通過高效液相色譜(HPLC)、液相色譜和質譜(LC/MS)驗證了合成的有效性琴许。³⁹肽合成完成后税肪，將肽分別分散在1ml MeOH和0.1 mL水中，超聲分離15分鐘直到完全分散榜田，然后用液相色譜-質譜(Waters 2695分離模塊連接Quattro Premier Micromass)進行鑒定益兄。樣本準備在水的混合物,乙腈和甲酸(80%:20%:0.1%)和分離(20μL注入)XBridge?肽本·C18柱(130?,5μm和4.6毫米x 150毫米)使用梯度洗脫的兩個移動階段(a -水:甲酸99.9%:0.1%,B -甲醇:甲酸;99.9%: 0.1%)。使用LC/MS (ESI處于正/負切換模式箭券，質量范圍為0-2000 Da)確認現(xiàn)有肽以及其他分子/雜質的所需m/z净捅。串聯(lián)質譜在數(shù)據(jù)庫中搜索所需的m/z。分析使用MassLynx質譜軟件(Waters)辩块。

2.2.3.高效液相色譜(HPLC)

如前所述灸叼，用高效液相色譜法對合成肽進行了表征神汹。³⁹HPLC分析采用 Agilent 1200系列。少量的樣品溶解在1ml MeOH和0.5 mL去離子水中古今。注射體積為20毫赫茲屁魏，紫外檢測波長為224-280納米。Phenomenex C18高效液相色譜柱(3.6×m粒徑捉腥，4.6×150 mm柱)氓拼，以MeOH / H2O(18分鐘梯度:5-95%，0.1%甲酸)組成的二元洗脫體系為流動相抵碟。工作壓力在2000- 3000psi范圍內桃漾。

2.2.4.CHF與肽的結合

一旦肽序列合成和化學結構分析，CHF開始結合產(chǎn)生兩親性肽拟逮，如之前報道的³⁷撬统。簡單地說，在40℃條件下敦迄，將多肽肽(1 eq.根據(jù)負載容量0.61 mmol/g)添加到含有CHF (2 eq.)和DIPEA (4 eq.)的DMF (4 mL)溶液中恋追。Kaiser試驗用于評估偶聯(lián)的完整性，重復此過程直到偶聯(lián)完全罚屋。將兩親性肽與5 mL裂解雞尾酒[由黃芪皂苷(TFA)苦囱、TIPS和水(9:0.5:0.5 v/v)]在室溫下有規(guī)律地搖動4 h，從樹脂中裂解脾猛，然后將溶液過濾到冰冷的乙醚中撕彤，離心。沉淀兩親性肽在乙醚中反復重懸猛拴，離心3次羹铅。乙醚在冰箱里過夜就蒸發(fā)了。將兩親性肽分散在水中愉昆，快速冷凍睦裳，冷凍干燥，得到的共軛肽為粉末撼唾。沒有采取進一步的步驟來環(huán)化肽中的半胱氨酸氨基酸或純化共軛肽廉邑。在結合肽裂解/沉淀后，通過凍干去除多余的TFA倒谷。因此蛛蒙，共軛肽是一種TFA鹽。

2.2.5.MMP-9酶激活

酶的激活是通過遵循制造商的協(xié)議來實現(xiàn)的渤愁。TCNB緩沖區(qū)(三羥甲基氨基甲烷(50毫米)液牵祟、CaCl₂(10毫米),NaCl(150毫米)和Brij 35(0.05%)]準備使用Trizma基礎(Tris)濃度的200mM,二水氯化鈣的濃度(CaCl₂)40mM,NaCl濃度的600mM(NaCl),Brij35濃度為0.2%。每個組分分別溶解在10毫升無菌水中抖格，然后從每個溶液中取出1毫升轉移到另一個容器中诺苹，達到所需的濃度咕晋。對5倍的MMP-9 (ThermoFisher, REF - 10327-H08H-5, LOT - lcl09au0402)，以100倍的增量向TCNB緩沖液中加入900倍的MMP-9 (ThermoFisher, REF - 10327-H08H-5, LOT - lcl09au0402)以溶解樣品收奔。然后加入APMA 100 mol / L掌呜，濃度為1 mM，最終得到濃度為64.4 nM的MMP-9溶液坪哄。此溶液在37℃下孵育24小時质蕉。隨后，加入3 mL TCNB緩沖液制備16 nM的MMP- 9溶液翩肌。將1ml的該溶液在TCNB緩沖液中進一步稀釋至8ml模暗，得到2nm的溶液用于核磁共振研究。

2.2.6款.動態(tài)光散射(DLS)分析和Zeta電位測量

使用Malvern Zetasizer Nano ZS?(Malvern念祭，伍斯特郡兑宇，英國)測量顆粒大小，其中包含一個氦氖激光源(λ= 632.8 nm粱坤，輸出功率為22 mW)隶糕。所使用的試管為DTS0012。水的折射率為1.3比规，粘度為0.9 cP。對分散在水中的兩親性肽樣品進行了三次檢測拦英。同樣的儀器也被用來測量zeta電位蜒什。所有的測量都進行了三次，同時計算了平均值和標準差(SD)疤估。

2.2.7.透射電子顯微鏡

利用FEI Morgagni透射電子顯微鏡對肽納米載體進行了形貌觀察和表征灾常。采用碳膜銅網(wǎng)格。用蒸餾水配制2.5 mg/mL肽溶液铃拇。一小滴肽溶液被放置在網(wǎng)格上并讓其干燥钞瀑。樣品干燥后用透射電鏡進行分析。未染色(陰性或陽性)慷荔。

2.2.8.制備納米顆粒分散

用無菌去離子水制備納米顆粒分散體雕什。程序在一個消毒的層流箱中進行，以制備2.5 mg/mL的兩親性肽懸液显晶。將懸浮液進行浴超聲處理1 h和45 min贷岸，以160 W(有效80 W)的超聲功率分散兩親性肽顆粒，形成納米顆粒膠體分散體VWR超聲清洗劑USC 300 TH 2.8 L 45 kHz (VWR International)磷雇。

2.2.9.透析

將大約15cm透析管浸泡在裝有水的燒杯中5分鐘偿警。在一個單獨的燒杯中，加入40毫升的蒸餾顆粒游離水唯笙，并用磁攪拌棒攪拌螟蒸。一旦管變靈活盒使，一端系結，將1ml兩親性肽納米載體懸液放入管內七嫌，另一端系結密封少办。然后將其放入含有磁棒的40毫升水中(稀釋40倍);用橡皮筋固定，然后燒杯放在攪拌板上抄瑟。熒光分光光度計上的參數(shù)設置為激發(fā)在270 nm凡泣，發(fā)射開始在300 nm，停止在400 nm皮假，狹縫寬度設置為20 nm鞋拟。使用熒光分光光度計(VARIAN CARY Eclipse，英國)惹资，只用水在四面透明石英試管中測量背景熒光贺纲。當時周圍的水的熒光強度測試時間分別是0,1,2,3,4,5,6,24 點。在每個采樣時間點,3毫升(1 x 3毫升)以外的透析袋放在4-clear試管和分析使用熒光分光光度法和強度測量來確定兩親性肽通過透析膜的釋放褪测。每次測試后猴誊，每個樣品返回燒杯，以保持體積在40毫升侮措。

然后懈叹，將NPs分散在胎牛血清(FBS)中，用蒸餾水在袋子外面進行同樣的透析程序分扎。所有的釋放研究重復了三次澄成。

2.2.10.酶抑制研究和酶動力學評價

使用Bruker?AscendTM 600 MHz NMR光譜儀進行酶學研究(NPs的抑制作用)。一維(1D)氟-19 (19F;采用室溫(298 K)質子解耦的方法進行核磁共振實驗畏吓，采用國內研制的含有4-氟苯丙氨酸的高靈敏度MMP-9肽(TY-26墨状，結果將另行發(fā)表)分析NPs的抑制作用。將一份MMP-9敏感肽(5 mg/mL)樣品(350°L)和400°L活化的MMP-9加入到核磁共振管中菲饼。這是對照樣本肾砂。在第二核磁共振管中加入相同的溶液和350mol / L的MMP-9抑制納米載體水分散體作為測試樣品。含4-氟苯丙氨酸的肽產(chǎn)物和代謝物被觀察為具有不同特征化學位移的單線體宏悦「淙罚化學位移值被校準為TFA (-76.55 ppm)作為內部標準。使用TopSpin?查看和分析獲得的數(shù)據(jù)饼煞，使用Dynamics centre 2.4.5 (Bruker?)處理和計算酶動力學辫塌。通過評估TCNB緩沖液中的MMP-9敏感肽以及MMP-9無反應肽(TY-27: GGYGQ- GYW¹⁹FG)在MMP-9存在下的降解情況，我們進行了進一步的對照試驗派哲。

2.2.11.細胞死亡誘導的評估

用乳酸脫氫酶(LDH)測定MMP-9抑制NPs的潛在毒性臼氨。HeLa細胞在添加了10%胎牛血清和2 mM l -谷氨酰胺的改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中生長。然后用磷酸鹽緩沖的生理鹽水清洗芭届，胰酶處理储矩，重新懸浮在生長培養(yǎng)基中感耙，計數(shù)并接種到不透明的、微透明的持隧、平底的96孔組織培養(yǎng)板中即硼，密度為7.5×104個細胞/mL(7500個細胞/孔，100L/孔)屡拨≈凰郑空白對照組中不含細胞(僅含完全培養(yǎng)基)。實驗設計包括3個重復孔呀狼，用于LDH測定對照組裂允。然后將96孔板在37℃、5% CO2的條件下孵育過夜哥艇。然后將納米載體一式三份加入培養(yǎng)孔中绝编。在陰性對照孔中加入無菌水。將處理過的96孔板在37℃貌踏、5% CO2的條件下孵育24小時十饥，然后按照制造商的方案(ThermoFisher, Pierce LH細胞毒性檢測試劑盒，Cat)進行LDH檢測祖乳。88953號)逗堵。包含在設計是一個自發(fā)的LDH活性控制(10μL無菌水,獲取最低LDH釋放,也就是說,完全代表0%健康細胞LDH釋放)和最大LDH活性控制(10μL (x裂解緩沖,將完全溶解細胞,表明100%的LDH釋放)。然后眷昆，將96孔板在37℃蜒秤、5% CO2的條件下再孵育45分鐘。在此孵育之后隙赁，從每個測試井或控制井中取出50百里升的培養(yǎng)基轉移到一個新的96孔平底板中垦藏。然后在每個孔中加入50立方摩爾的反應混合物梆暖，輕輕地敲擊板子伞访。在室溫下孵育30分鐘，并蓋上錫箔以避光轰驳，然后在每個孔中加入50°L的停止溶液(強酸)厚掷，輕輕敲打混合。任何產(chǎn)生的氣泡都用注射器針頭去除级解。然后使用Clariostar平板閱讀器(BMG Labtech)冒黑，從陰性控制值和每個處理值中減去空白孔(不含細胞)的值。在680 nm處的合成值減去480 nm處相應的合成值勤哗。然后抡爹，通過將陰性對照的值或每個處理的值表示為LDH最大釋放值的百分比來分析這些最終值。研究了三種細胞傳代芒划。

2.2.12.血腦屏障體外模型制備及移行實驗

體外血腦屏障模型采用Merck Millipore公司提供的方案構建冬竟。通過體外血腦屏障模型欧穴，利用永生化的人腦內皮細胞系hCMEC/D3，研究血腦屏障的通透性泵殴。簡單地說涮帘，90000個細胞接種在24孔的TC-inserts中，并加入500μL的EndoGRO培養(yǎng)基和補充物(包括血清和VEGF);將1.6 mL相同的培養(yǎng)基加入到包含插入物的孔中笑诅。將平板置于37℃调缨、5% CO₂的培養(yǎng)箱中。24小時后吆你，使用EVOM²(世界精密儀器公司弦叶，美國)測量跨皮/內皮電阻(TEER)。在進行通透性實驗之前早处，先用組胺和西咪替丁檢測血腦屏障單層的敏感性湾蔓。簡單地說，培養(yǎng)基被替換砌梆，組胺被添加到最終濃度為50μM的插入物中默责。37℃孵育30分鐘。36 h測定TEER值咸包，用無菌PBS緩沖液清洗細胞桃序，加入新鮮培養(yǎng)基。西咪替丁是在最后一次50μM時被添加到插入物中烂瘫。孵育1 h媒熊，測量TEER值。將培養(yǎng)基替換為新鮮培養(yǎng)基坟比，孵育12 h, 48 h后再次測定TEER值芦鳍，并通過轉移試驗測定TEER值。所有的測量都進行了三次葛账，同時計算了平均值和標準差(SD)柠衅。

?在轉驅研究中，將hCMEC/D3細胞以90000個細胞/培養(yǎng)基接種48h籍琳，測量TEER值以確保生物屏障的形成菲宴。將培養(yǎng)基替換為新鮮培養(yǎng)基，將NPs添加到根尖側趋急，最終濃度為0.4 mg/mL喝峦。濃度(NPs BBB的單層評估通過測量熒光管基底室在λexc 270 nm和λems 341海里通過SpectraMax i3x多模檢測板讀者(美國分子設備)。

NPs在血腦屏障上的轉運由公式1計算:

% 的 NPs 在 基本的 Chaner = <u>t時刻基腔內NP熒光</u> × 100

                                   方程1（1 eq）

式中“t時刻基腔內NP熒光”表示某一時刻基腔內NPs的熒光;“總NP的熒光”是指將所有NP樣本加入基底外側室時NPs的熒光呜达。表觀滲透率(Papp)按以前報道的方法計算谣蠢。⁴⁰

在24h時對基底外側室內的NPs進行最終熒光測量后，再次測量TEER值，并將培養(yǎng)基替換為預熱的新鮮培養(yǎng)基眉踱。在根尖側加入fitc -右旋糖酐溶液(1mg/mL) 10μL勋颖，測定基底側室的熒光(λexc 485 nm, λems 520 nm)。該實驗被重復了三次勋锤。

2.2.13.統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism8.0.1版（Windows版） (GraphPad Software, Inc.饭玲， La Jolla, CA, USA)進行單因素方差分析(ANOVA)，然后進行Tukey 's事后多重比較檢驗叁执，以確定處理組之間的統(tǒng)計顯著性差異茄厘。統(tǒng)計學上，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義谈宛。

3.結果

??3.1.表征納米粒子的化學結構次哈，尺寸分布和形態(tài)

??我們檢測了三種兩親性肽(表1)。在這些化合物中檢測了兩種類型的腦靶向配體:MiniAp-3 (CKAPETALC)⁴¹和HAI peptide (HAIYPRH)⁴²吆录。此外窑滞，在MMP-9抑制劑肽的N端，三個甘氨酸殘基被合并作為MMP-9抑制劑肽和膽固醇之間的間隔物恢筝。HPLC數(shù)據(jù)(補充信息S1和S2)表明肽1和肽2的半胱氨酸之間形成了二硫橋(圖S1在保留時間為13.7和14.0 min時峰哀卫，圖S2在保留時間為15.9和16.4 min時峰)。對于肽3,17.5 min時峰值(Supp. Figure S3)表明肽中半胱氨酸氨基酸之間形成了二硫化橋撬槽。這些觀察結果表明此改，盡管沒有采取任何有意的步驟來進行肽的環(huán)化，肽在從樹脂中裂解后仍然進行了原位環(huán)化(但不完全)侄柔。LC/MS數(shù)據(jù)證實肽3的合成成功(圖S4)共啃。在這些多肽中，只有序列為GGGCTTHWGFTLCHAIYPRH的肽3與膽固醇成功偶聯(lián)暂题。另外兩個肽段在Kaiser試驗中未顯示與CHF結合移剪。因此，肽3的結果如下薪者。LC/MS數(shù)據(jù)和紫外色譜圖顯示了CHF與肽序列的偶聯(lián)(Supp.圖S5和S6)纵苛。偶聯(lián)肽3的計算質量為2626.13 Da;在1314.5處的m/z表示雙荷電共軛肽3，在876.9處的m/z表示三荷電肽啸胧，在738.5處的m/z表示CHF裂解肽3赶站。mmp -9抑制劑NPs的平均粒徑為202.8±105.6 nm幔虏，多分散性指數(shù)(PdI)為0.2(圖2)纺念，zeta電位為+26.7 mV。TEM圖像顯示MMP-9抑制劑NPs呈不規(guī)則形狀(圖3)想括。由于這是一項初步研究陷谱，我們預計只有偶聯(lián)肽才能形成納米顆粒，因此我們沒有純化偶聯(lián)肽。

??3.2.MMP-9抑制研究

??圖4A為MMP-9酶存在20小時后MMP-9可裂解肽(TY-26) NMR信號的典型變化烟逊，可以看出完整肽信號(-117.5 ppm)逐漸減少渣窜，出現(xiàn)降解產(chǎn)物信號(-117.2 ppm)。20 h后降解產(chǎn)物信號清晰可見宪躯，MMP-9可裂解肽的降解速率常數(shù)為4.5×10^-6 s^-1乔宿。另一方面，在MMP-9抑制劑NPs存在的情況下访雪，TY-26的裂解被MMP-9酶完全阻斷(圖4B)详瑞。在重復運行中，我們發(fā)現(xiàn)在MMP-9酶和MMP-9抑制劑NPs的存在下臣缀，TY-26的裂解減少到1.9×10^-6 s^-1(補充圖S7)坝橡。TY-26的解理變化可能是由于NPs中的雜質所致。在TNCB緩沖區(qū)存在的情況下精置，TY-26沒有明顯退化(圖S8)计寇。此外，MMP-9無反應肽(TY-27)在MMP-9存在時沒有降解(圖S9)脂倦。這些對照試驗表明番宁，在MMP-9酶存在的情況下，TY-26降解受到抑制赖阻，MMP-9抑制NPs贝淤。

??3.3.MMP-9抑制納米顆粒的無毒作用

??圖5顯示了評估MMP- 9抑制NPs對LDH釋放的潛在影響的實驗結果。LDH釋放增加表明細胞死亡增加政供。試驗濃度的NPs沒有誘導LDH的釋放播聪，與陰性濃度相比有顯著差異。陰性對照組的LDH釋放百分率為18.2±2.6%布隔，而NPs在0.06 mg/mL离陶、0.14 mg/mL和0.25 mg/mL時，分別為19.3±3.3%衅檀、19.3±4.7%和17.1±2.6%招刨。單因素方差分析沒有顯示對照組細胞和處理細胞(所有濃度)之間LDH釋放百分比的統(tǒng)計學差異(P=0.9)。

??3.4.MMP-9抑制納米顆粒的透析體外崩解

??進行崩解(釋放)研究哀军，以確定抑制NPs的MMP-9是否會在稀釋后(例如靜脈注射后)降解沉眶。圖6顯示，NPs在40 mL蒸煮水中孵育6小時后杉适，熒光強度從155.7±28.7 a.u輕微增加到235.2±33.9 a.u谎倔。典型的熒光曲線如圖S10所示。這表明MMP-9抑制NPs的臨界膠束(聚集)濃度遠低于37 mg/L猿推。然而片习，當MMP-9抑制NPs的釋放介質與胎牛血清孵育24小時后捌肴，熒光強度顯著從158.7±30.8 a.u增加到445.1±68.1 a.u。然而藕咏，降解過程分為兩步状知。從圖6中可以看出，在第一步中孽查，在胎牛血清存在的情況下饥悴，5小時內熒光強度僅從158.7±30.8 a.u增加到218.9±27.9 a.u。在胎牛血清中孵育24小時后盲再，熒光強度躍至445.1±68.1 a.u铺坞。這一觀察結果表明，NPs是被血清中的酶降解的洲胖，而不是被稀釋后的降解济榨。此外，抑制NPs的MMP-9不會被血清酶迅速降解绿映。

??3.5.MMP-9抑制納米顆粒體外血腦屏障遷移的研究

??BBB的t值模型達到239±28Ωcm² 48 h后孵化;后略增至250±13Ωcm²MMP-9抑制NPs細胞的治療擒滑。組胺治療了t值從200Ωcm² 減少到62Ωcm²。而與西咪替丁治療幫助TJ恢復其完整性145Ωcm²如圖7所示叉弦。

??MMP-9抑制NPs顯示穿過體外BBB的能力(圖8)丐一。NPs穿過BBB模型的比例達到23±5%經(jīng)過兩個小時的孵化和達到28±3% 5 h。然而,圖8顯示了減少,雖然不明顯,NPs的數(shù)量(從頂端的BBB模型基底外側5 h后,在24小時減少到22%±3%淹冰。這一趨勢更明顯Papp計算時(圖9)库车。從圖9可以看出Papp下降2 h后孵化后,表明沒有輪回的凈增長NPs在基底外側隔間。Papp的負值顯示了基底外側腔室NPs總數(shù)量的凈減少樱拴。這一觀察提示一些NPs從模型的基底外側返回到根尖側柠衍。NPs處理細胞后，觀察到只有0.5±0.1%的fitc -右旋糖酐通過體外血腦屏障模型晶乔，說明NPs不影響血腦屏障的通透性珍坊。

??4. 討論

??這項工作證明了制備含有腦靶向配體的硬核肽基NPs，具有MMP-9抑制特性正罢。NPs被證明是無毒的阵漏，平均直徑為200nm。在基于¹⁹F NMR的檢測中翻具，NPs能夠完全或一半地降低MMP-9酶的活性履怯。重要的是，NPs在稀釋后仍然保持其完整性裆泳，但可以被血清中的酶逐漸水解叹洲。此外，抑制NPs的MMP-9顯示了通過體外血腦屏障模型的能力晾虑。在這項工作中疹味，我們沒有研究沒有腦靶向配體的NPs的能力。這是基于其他研究者的觀察得出的結論帜篇，即包括腦靶向配體可以顯著提高NPs在靜脈注射后穿越血腦屏障的能力^43-47糙捺。

??在之前的研究中，磁nps結合的TMP-1的大小為10±3 nm¹⁷,笙隙，同樣表面吸附在量子點(QD-siRNA nanoplexes)上的siRNA直徑為15-20 nm¹⁶洪灯。這些比我們在本研究中發(fā)現(xiàn)的MMP-9抑制NPs小得多，但是與之前的研究相比竟痰，我們的NPs呈現(xiàn)出不規(guī)則的形狀^16,17签钩。本研究中磁性NPs¹⁷,和MMP-9抑制NPs的PdIs相似。在另一項研究中坏快，封裝TMP-1的PLGA NPs的直徑在80nm到430 nm之間(取決于TMP-1的負載)¹⁸;PLGA NPs是球形的铅檩。此外,Cu@mSiO2-PEG NPs在HeLa細胞中表現(xiàn)出對MMP-9的抑制作用⁴⁸。這些NPs的形狀也不規(guī)則莽鸿，但平均直徑為179.7nm⁴⁹昧旨。因此，我們研究的MMP-9抑制NPs的大小在之前的研究范圍內祥得。此外兔沃，這些相對較大的NPs有望使其駐留在腦屏障的基板上⁵⁰，這將是有益的级及，因為位于腦屏障的MMP-9增加了腦屏障的通透性乒疏，從而導致神經(jīng)元損傷⁵¹。

??研究人員已經(jīng)開發(fā)出降低MMP-9表達的配方饮焦。例如怕吴，Cu@mSiO2-PEG NPs降低了HeLa細胞48中MMP-9的表達，QDsiRNA nanoplexes降低了腦微血管內皮細胞中MMP-9表達78%县踢。此外械哟，包覆MMP-9的固體脂質nps下調shrna可使人角膜上皮細胞中MMP-9的分泌減少30%。52我們的NPs抑制MMP-9的能力是通過使用一種特殊設計和優(yōu)化的基于19F NMR的分析來研究的殿雪，該分析測量MMP-9治療后與對照組相比剩余的19F標記肽暇咆。本研究中抑制MMP-9的NPs濃度為480mol / l，可以完全或一半降低MMP-9的活性丙曙。NPs抑制MMP-9性能的變化可能是由于NPs中的雜質所致爸业。因此，需要使用純化的共軛肽進行進一步的實驗來驗證這一假設亏镰。CTTHWGFTLC肽對MMP-9的抑制作用IC₅₀約為500 μM³¹扯旷。

??因此，含CTTHWGFTLC肽的MMP-9抑制NPs在溶液中表現(xiàn)出與單獨母肽相當?shù)囊种苹钚运髯ァＴ诹硪豁椦芯恐芯觯?jīng)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)穩(wěn)定的金NPs在400μg/mL時完全阻斷了MMP-9的活性⁵³毯炮。在我們的MMP-9抑制研究中，金納米顆粒的濃度明顯低于抑制MMP-9的納米顆粒濃度(1.25 mg/mL)耸黑。因此桃煎，金NPs對MMP-9的抑制比肽基MMP-9對NPs的抑制更有效。但值得注意的是大刊，金NPs可以激活小膠質細胞⁵⁴为迈，而抑制mmp -9的NPs可以被體內的酶消化。

??在本研究中缺菌，MMP-9對NPs的抑制作用達到250μg/mL葫辐，對HeLa細胞沒有明顯的毒性，其他納米顆粒制劑也有類似的結果^17,52,53;而pdp包覆的鉑NPs在100μg/mL的濃度下確實表現(xiàn)出了細胞毒性⁵³伴郁。此外耿战，磁性NPs結合的TMP-1 NPs在濃度超過氧化石墨烯10μg/mL時表現(xiàn)出細胞毒性¹⁷。這些觀察結果表明焊傅，在我們的研究中昆箕，MMP-9抑制NPs，即使?jié)舛雀哌_(250 μg/mL)租冠，也不存在任何毒性問題鹏倘。不同于以前報道的某些配方^17,53。在這項工作中顽爹，我們評估了MMP-9抑制NPs在HeLa細胞(分裂和生長異诚吮茫快)中的毒性，類似于之前的工作⁵⁵镜粤。這主要是由于血清存在于hCMEC/D3培養(yǎng)基中捏题，它可能消化MMP-9抑制肽，并掩蓋NPs的毒性作用肉渴。然而公荧，使用MMP-9抑制NPs后，血腦屏障模型的TEERs值并未下降同规。這也顯示了NPs對hCMEC/D3細胞的無毒作用疾牲，因為已有研究表明噪馏，細胞毒性物質降低了體外血腦屏障模型的TEER值⁵⁶唁盏。也許松申，毒性研究也可以在大腦內皮細胞和神經(jīng)元細胞中進行^16,17。

??在納米顆粒配方上面所討論的,在上述討論的納米顆粒配方中关炼，PVP穩(wěn)定金NPs ⁵³程腹，CuS@mSiO2-PEG NPs⁴⁸, 和MMP-9抑制NPs我們的工作不需要加載一個活性成分,如TIMP-1^16-18,52。因此,MMP-9抑制NPs在擴大我們的研究將會更少的挑戰(zhàn)相比其他方法治療腦部疾病,當干擾MMP-9增加大腦的活動儒拂。然而寸潦，值得注意的是色鸳，我們注意到膽固醇氯甲酸酯的共軛過程緩慢。因此见转，還需要進一步的研究來優(yōu)化這一過程命雀，甚至用合成更容易處理的疏水肽序列來替代膽固醇基序，從而通過這些兩親性肽在水介質中自組裝形成NPs^57-63;可提高規(guī)模池户。在這種方法中咏雌，需要使用圓二向色性進行研究凡怎，以確定肽二級結構在形成自組裝納米粒子中的作用⁶⁴校焦。

??在這里，我們發(fā)現(xiàn)與Mini-app3 (CKAPETALC)相比统倒，HAI peptide可以更有效地與mmp抑制肽(CTTHWGFTLC)結合寨典。在以前的工作中，聚山梨酯80被用來促進NPs通過血腦屏障¹⁸房匆。而在另一項工作中耸成，使用了0.08 T的磁場，使磁性NPs通過血腦屏障的BBB¹⁷浴鸿。腦靶向配體的使用不需要申請磁場井氢。此外，聚山梨酯80的使用可能會在肺部積聚NPs¹⁹岳链。然而花竞，在我們的研究中，只有28%(最多)的MMP-9抑制NPs通過了體外血腦屏障掸哑，而在磁場的影響下约急，磁性NPs可以達到40%左右。值得注意的是苗分，使用hCMEC/D3的體外血腦屏障模型可能不能代表生理血腦屏障厌蔽。研究表明，該屏障對fitc -葡聚糖(mw70kda)是不可滲透的摔癣，但對較小分子量的fitc -葡聚糖(mw4kda)是可滲透的⁶⁵奴饮。此外，我們工作中使用的血腦屏障模型缺乏血腦屏障的其他組成部分择浊，如星形膠質細胞和周細胞拐云，或者是動態(tài)的^66-68。然而近她，通過使用靜態(tài)的單層腦內皮細胞(如我們的模型)叉瘩，在體內和體外數(shù)據(jù)之間已經(jīng)觀察到良好的相關性^64,69。最終粘捎，體內研究將進一步表明MMP-9抑制NPs穿過血腦屏障的能力薇缅。體內研究將考慮通過血腦屏障危彩、與血漿蛋白結合、網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)的清除以及血清中的酶解⁷⁰泳桦。在我們的研究中汤徽，MMP-9抑制NPs的作用在體外血腦屏障模型孵育2小時后出現(xiàn)交叉¹⁷。這與先前發(fā)表的作品一致灸撰。有人認為谒府，在這一時期，部分NPs可能被網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)從血液中清除浮毯。體內研究表明完疫，當3小時后，只有10%的外泌體通過BBB血腦屏障模型時债蓝，外泌體包裹的金納米顆粒發(fā)生了顯著的腦吸收⁶⁹壳鹤。這表明，當體外數(shù)據(jù)顯示低水平的NPs穿過血腦屏障時饰迹，體內數(shù)據(jù)可能顯示完全相反的情況芳誓。

??含膽固醇的兩親性肽自組裝形成納米顆粒，并測量臨界膠束濃度(CMC)³⁷啊鸭∏绿剩基于這一觀察，我們推測我們研究的NPs是通過自組裝形成的赠制。然而赂摆，長時間的聲波作用形成不規(guī)則形狀的納米顆粒，使兩親性肽能否在分子水平上分散在水介質中用于CMC測量產(chǎn)生了疑問憎妙。盡管這一性質創(chuàng)造了一個優(yōu)勢库正，即NPs不會在稀釋后分解。

??MMP-9抑制NPs的可用性(如本研究所示)可用于缺血性腦卒中的治療⁷¹厘唾。在之前的工作中褥符，以聚乙二醇-b聚(D, L-丙交酯)共聚物，并加載姜黃素制備了高分子NPs抚垃。NPs的大小分布為147.8±5.7 nm喷楣。納米載體未裝飾有腦靶向配體，并將其靜脈注射給缺血/再灌注損傷的小鼠鹤树。納米載體出現(xiàn)在缺血/再灌注損傷的區(qū)域铣焊，降低了缺血皮質中MMP-9的表達，有助于減少梗死面積罕伯，改善功能恢復⁷²曲伊。納米載體可能通過缺血區(qū)受損的緊密連接穿過血腦屏障⁷²。應該注意的是，在急性缺血性中風中坟募，血腦屏障會迅速被破壞岛蚤，并且這種破壞會持續(xù)數(shù)天^73,74。人腦梗死區(qū)血腦屏障的通透性從0.83 mL/100 g /分鐘增加到1.15 mL/100 g /分鐘⁷³懈糯。因此涤妒，BBB的滲透率提高了約38%。這仍然是一個強大的障礙赚哗，以允許足夠的NPs跨越BBB她紫。因此，如前文所示屿储，當NPs表面裝飾有腦靶向配體時贿讹，更多的NPs進入大腦，治療效果明顯改善⁷⁵扩所。這些觀察結果表明围详，NPs的表面應飾以腦靶向配體朴乖，以達到治療缺血性中風的顯著/期望的臨床效果祖屏。此外，高血糖患者血清中MMP-9水平升高买羞，這使他們容易因血腦屏障受損而中風⁷⁶袁勺。因此，安全的抑制NP形成的MMP-9對這些患者是有益的畜普。

??先前的一項研究對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠腹腔注射0.5 mg/kg(12.43μg/家鼠)三螺旋MMP-9抑制肽;臨床嚴重程度從第12天(誘導后)開始降低⁷⁷期丰。由于這些肽不含腦靶向配體，但顯示出臨床療效吃挑，因此可能建議相似的劑量將適用于體內工作钝荡。然而，考慮到靜脈給藥的NP通常有1%到達腦舶衬，小鼠腦脊液體積為⁷⁵和35μL埠通，則MMP-9抑制腦內NP濃度為3.5 mg/mL，每只小鼠劑量為12.42μg逛犹。由于我們的體外數(shù)據(jù)顯示端辱，在1.25 mg/mL時MMP-9活性降低，那么在體內研究中虽画，0.5 mg/kg的劑量可能足以抑制小鼠大腦中的MMP-9舞蔽。這些計算是基于MMP-9抑制NPs會在體內通過血腦屏障的假設。

??這項研究也有局限性码撰。首先渗柿，應在體內測試MMP-9抑制NPs，如先前報道的EAE小鼠中脖岛，大腦中MMP-9水平升高會導致神經(jīng)退行性變^77,78朵栖。這也將有助于測試蛋白冠對NPs抑制MMP-9的效果的影響砾省。第二，在NPs結構中加入不同MMP-9抑制活性的肽混槐，以測試MMP-9的抑制活性是否僅來源于MMP-9抑制肽编兄。第三，應檢測抑制NPs的MMP-9的血液相容性声登，如補體活化狠鸳、溶血和血小板聚集。在這項工作中悯嗓，我們沒有研究我們的MMP-9抑制NPs對大腦中其他酶如MMP-2的潛在抑制作用⁷⁷件舵。因此，如果需要對MMP-9進行排他性抑制脯厨，就應該考慮到這一方面铅祸。

5. 結論

??我們的工作提出了開發(fā)基于肽的MMP-9抑制NPs的概念證明，能夠顯著降低MMP-9的活性合武。NPs包括腦靶向HAI肽配體临梗，有助于通過體外血腦屏障模型。重要的是稼跳，NPs的細胞毒性在濃度達到250磅/毫升時沒有表現(xiàn)出來盟庞。此外，與之前報道的用于腦藥物傳遞的納米顆粒制劑相比汤善，這些制劑具有可擴展性和不需要裝載活性成分的優(yōu)點什猖。此外，NPs的平均直徑為202.8±105.6 nm, PdI為0.2红淡，這使得NPs適合留在血腦屏障的基礎層不狮，在那里，內皮細胞或巨噬細胞釋放的MMP-9活性會影響血腦屏障的通透性在旱。我們設想,所述體外的概念可以作為一個平臺新體外和體內研究發(fā)展的一個新類brain-targeting MMP-9抑制劑治療進行性神經(jīng)退行性疾病和腦損傷,當MMP-9不受歡迎的活動增加摇零。

6. 感謝

??我們感謝奧利維亞·富蘭克林、奧斯卡妇痹ǎ·阿拉比和克洛伊·杰拉蒂提供的技術援助遂黍。

7. 對利益的承認

作者聲明沒有利益沖突。