細胞培養(yǎng)藏雏，看似簡單的一個實驗拷况，卻不知道把多少英雄豪杰折磨的意欲“自掛東南枝”~今天科研小助手就為大家盤點一下細胞復(fù)蘇、傳代到凍存的一些步驟和注意事項，希望廣大科研汪能與細胞愉快的玩耍赚瘦！
細胞復(fù)蘇
細胞復(fù)蘇的原則－快速融化：
必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃粟誓，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化捆探，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶玄渗，對細胞造成損害耘婚。
具體操作：
一. 實驗前準(zhǔn)備：
1. 將水浴鍋預(yù)熱至37℃辐马。
2. 用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面您觉。
3. 完全培養(yǎng)液：DMEM高糖＋10% FBS＋1% P/S（培養(yǎng)Siha竹宋、Hela）救斑。
4. 在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管泵琳、吸管心褐、槍頭舔涎、培養(yǎng)瓶等等。
二．細胞復(fù)蘇培養(yǎng)：
1. 根據(jù)細胞凍存記錄取出需要復(fù)蘇的細胞逗爹。
2. 迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍亡嫌，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化掘而。
3. 約1-2 min后凍存管內(nèi)液體完全溶解（一般細胞凍存量為1ml）挟冠，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到裝有約10ml已預(yù)熱的含血清完全培養(yǎng)液離心管中（目的：稀釋去除凍存液中的DMSO），取出放入離心機中以1000 rpm/min速度離心3~5 min袍睡。
4. 用酒精棉球擦拭凍存管的外壁知染，再拿入超凈臺內(nèi)。吸棄上清液斑胜，向離心管內(nèi)加入1 ml培養(yǎng)液控淡，吹打制成細胞懸液。
5. 將細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿內(nèi)止潘，將培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿放入37℃掺炭，5％ CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)過夜后換液繼續(xù)培養(yǎng)，換液的時間由細胞情況而定凭戴。
初學(xué)者易犯錯誤：
1. 水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃涧狮。
2. 水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳簇宽，使融化時間延長勋篓。
3. 離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機損壞和細胞丟失魏割。
4. 一次復(fù)蘇細胞過多譬嚣，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細胞交叉污染钞它。
細胞傳代
具體操作：
一. 傳代前準(zhǔn)備：
1. 預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液拜银、PBS液和胰蛋白酶(Gibco 胰蛋白酶-EDTA (0.25%)殊鞭，含酚紅)的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。
2. 用75％酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手尼桶。
3. 正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間操灿，不僅便于操作而且可減少污染。
4. 點燃酒精燈：注意火焰不能太小泵督。
二趾盐、細胞傳代：
1. 取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)小腊。
2. 從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞：注意培養(yǎng)瓶取出細胞時要旋緊瓶蓋救鲤，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞秩冈。
3. 將培養(yǎng)瓶放入超凈工作臺后打開瓶口本缠，同時要在酒精燈上燒口消毒。
4. 加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液（不要直接倒掉入问，避免瓶口殘留導(dǎo)致易污染）丹锹，用不含鈣鎂離子的PBS清洗（與貼壁細胞層相對的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動細胞層芬失，前后搖晃容器數(shù)次楣黍；目的是洗去殘留的血清，避免影響胰酶的活性棱烂。）锡凝，加入適量消化液（以 T-25 的培養(yǎng)瓶為例，向瓶內(nèi)加入1ml胰蛋白酶（請根據(jù)各細胞的指引使用合適的濃度））垢啼，注意消化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37℃张肾，反應(yīng)3~5分鐘芭析。
5. 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質(zhì)回縮吞瞪，細胞之間不再連接成片馁启，表明此時細胞消化適度。
6. 棄去胰蛋白酶液芍秆，加入2-3ml新鮮的含血清的完全培養(yǎng)液終止消化反應(yīng)惯疙，小心吹打成細胞懸液。
7. 將細胞懸液吸入10 ml離心管中妖啥。平衡后將離心管放入離心機中霉颠，以1000 rpm/min離心5 min。
8. 棄去上清液荆虱，加入適當(dāng)體積的培養(yǎng)液蒿偎，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液朽们。
9. 將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋诉位。
10. 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量骑脱，必要時計數(shù)。注意密度過小會影響傳代細胞的生長苍糠，傳代細胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml叁丧。最后要做好標(biāo)記。
11. 繼續(xù)培養(yǎng)：用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶岳瞭，適當(dāng)旋松瓶蓋拥娄，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細胞2-4 h后開始貼附在瓶壁上寝优。
注意事項：
1.嚴(yán)格的無菌操作
2.適度消化：消化的時間受消化液的種類条舔、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響乏矾，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化孟抗，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散钻心，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化凄硼。
細胞凍存
具體操作：
一、凍存前準(zhǔn)備
1. 準(zhǔn)備適量凍存管捷沸，做好標(biāo)記后置于4℃冰箱預(yù)冷摊沉；
2. 配制凍存液，一般為用培養(yǎng)液配制10% DMSO痒给；
3. 梯度凍存盒说墨。
二、細胞凍存：
1. 按照細胞傳代步驟1-7操作制備細胞懸液并離心苍柏；
2. 棄去上清尼斧，加入適當(dāng)體積的凍存液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液试吁；
3. 將1 ml細胞懸液（細胞的終密度為5~10×105個/ml）加入之前已做好標(biāo)記的凍存管中并做好記錄棺棵；
4. 將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過夜（如果沒有凍存盒，可以先在4℃冰箱放置30 min熄捍，然后轉(zhuǎn)移至-20℃放置1-2 h烛恤，最后轉(zhuǎn)移至-80℃過夜），第二天取出放入液氮罐余耽，并記錄好位置信息缚柏。
DMSO的作用是取代細胞中的一些水，以防止冰晶形成宾添，刺穿細胞船惨。據(jù)賽默飛世爾科技的資深科學(xué)家Rhonda Newman介紹柜裸，DMSO還能防止細胞在冷凍期間發(fā)生收縮，而后在解凍時又變得腫脹粱锐。
細胞凍存液一般有兩種配置方法：
1.培養(yǎng)基：血清：DMSO=7：2：1
2.血清：DMSO=9：1
普通細胞系可以用第一種配方凍存疙挺，比較嬌貴的細胞系用第二種配方凍存。
注意事項：
1. 使用DMSO前怜浅，不需要進行高壓滅菌铐然，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破華它的分子結(jié)構(gòu)恶座，以至于降低冷凍保護效果搀暑。在常溫下，DMSO對人體有害跨琳，故在配制時最好戴上手套操作自点。
2. 不宜將凍存細胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內(nèi)過久，低溫損傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)脉让，是“危險溫區(qū)”桂敛。
3. 注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時添加溅潜。
