這次分享的是遺傳所周儉民老師在2018年發(fā)表在《The Plant Cell》上的paper啡直，"Receptor-Like Cytoplasmic Kinases Directly Link Diverse
Pattern Recognition Receptors to the Activation of Mitogen-
Activated Protein Kinase Cascades in Arabidopsis"。周儉民老師是國(guó)內(nèi)做植物免疫的標(biāo)桿性人物，希望能從他們的試驗(yàn)設(shè)計(jì)上學(xué)到些東西。

Abstract

植物部署大量的細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(PRRs)來(lái)感知宿主和微生物產(chǎn)生的分子模式照雁，這些模式是在感染過(guò)程中特別釋放的饼记，并激活防御反應(yīng)。有絲分裂原活化蛋白激酶MPK3揽趾、MPK4和MPK6 (MPK3/4/6)的激活是所有已知PRRs激活免疫系統(tǒng)的一個(gè)標(biāo)志，對(duì)建立抗病性至關(guān)重要苛骨。MAPKKK中的MEKK1控制MPK4的激活篱瞎，但是在不同PRRs下游中負(fù)責(zé)MPK3/6激活的MAPKKKs苟呐，以及對(duì)不同分子模式的識(shí)別是如何導(dǎo)致MAPKKKs激活的，仍然是一個(gè)謎俐筋。在這里牵素，我們展示了兩個(gè)高度相關(guān)的MAPKKKs MAPKKK3和MAPKKK5，通過(guò)至少4個(gè)PRRs來(lái)介導(dǎo)MPK3/6的激活澄者，并賦予擬南芥對(duì)細(xì)菌和真菌的抗性笆呆。RLCK VII家族，在PRRs的下游發(fā)揮作用粱挡，直接磷酸化MAPKKK5的第599位Ser赠幕，然后導(dǎo)致了MPK3/6的激活、防衛(wèi)基因的表達(dá)和抗病性的產(chǎn)生询筏。有意思的是榕堰，MPK6進(jìn)一步磷酸化MAPKKK5 682位 Ser和692位的Ser來(lái)增強(qiáng)MPK3/6的激活與抗病性，顯示了一個(gè)正反饋機(jī)制嫌套。最后逆屡，MEKK1 603位的Ser被RLCK VII和MPK4磷酸化，這是觸發(fā)的MPK4激活所必需的踱讨。這些發(fā)現(xiàn)闡明了多種PRRs激活MAPK級(jí)聯(lián)和抗病的中心機(jī)制康二。

Introduction

PRR作為植物免疫檢測(cè)系統(tǒng)的第一道防線，早被人所知的有FLS2(FLAGELLIN SENSITIVE2)勇蝙、EFR(EF-TU RECEPTOR)沫勿、LYK5(LYSIN MOTIF RECEPTOR KINASE5)、PEPRs(PLANT ELICITOR PEPTIDE RECEPTORs)味混。感知到相應(yīng)ligand后产雹，F(xiàn)LS2、EFR翁锡、PEPRs與它們的共受體BAK1(BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1-ASSOCIATED KINASE1)形成異源二聚體蔓挖。感知到chitin后，LYK5與其共受體CERK1形成復(fù)合物馆衔。數(shù)分鐘后瘟判，PRRs激活下游一系列的防衛(wèi)反應(yīng)，包括鈣離子從質(zhì)外體的瞬時(shí)流入角溃、鈣依賴性蛋白激酶的激活拷获、胞外ROS的產(chǎn)生和MAPKs的激活。

PRR或共受體的下游被認(rèn)為是第七類RLCK家族來(lái)傳遞信號(hào)减细。BIK1(BOTRYTIS-INDUCED KINASE1)整合了來(lái)自多個(gè)PRRs的信號(hào)匆瓜，包括FLS2, EFR, PEPRs, and LYK5。感知到信號(hào)后，BIK1直接磷酸化NADPH氧化酶 RBOHD來(lái)產(chǎn)生初級(jí)的ROS驮吱。

迄今為止研究的所有PRR都激活了兩個(gè)MAPK級(jí)聯(lián)茧妒。一類級(jí)聯(lián)由MAPKKK -MEKK1、MAPKK-MKK1和MKK2以及MPK4組成(也就是從3K到2K再到1K)左冬；另一類級(jí)聯(lián)由兩個(gè)MKKs, (MKK4和MKK5)桐筏，兩個(gè)MAPKs,(MPK3和MPK6)組成。后面這一級(jí)聯(lián)反應(yīng)在植物免疫中有更重要的作用拇砰，能夠激活基因表達(dá)梅忌、植物抗毒素和乙烯的合成及氣孔免疫。矛盾的是毕匀，控制各種PRR下游第二類MAPK級(jí)聯(lián)的MAPK的MAPKKKs仍然難以捉摸。而不同PRRs認(rèn)為集中在同一MAPKKKs 來(lái)進(jìn)行MAPK激活,最近的一份報(bào)告表明,MAPKKK5和PBL27(RLCK VII類家族成員),正調(diào)節(jié)chitin介導(dǎo)的 MPK3/6激活但負(fù)調(diào)控flg22介導(dǎo)的 MAPK激活【有意思的是癌别，本文作者并沒(méi)有得出該結(jié)論皂岔，也沒(méi)有對(duì)人進(jìn)行debate，說(shuō)這是試驗(yàn)條件不同導(dǎo)致的】展姐。

Results

MAPKKK3/5 Are Phosphorylated in Response to Multiple Patterns

通過(guò)分析擬南芥的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)得到接病后受誘導(dǎo)最高的3k激酶-MAPKKK5躁垛。構(gòu)載體，如圖1A圾笨。Lys375Met破壞了MAPKKK5自身磷酸化教馆，便于查看其上游對(duì)其進(jìn)行磷酸化的激酶。在原生質(zhì)體中表達(dá)載體擂达，并用flg22處理土铺。全長(zhǎng)的MAPKKK5和MAPKKK5^K375M顯示有磷酸化現(xiàn)象，且不依賴flg22處理【作者對(duì)這里的解釋是：大的磷酸化的蛋白在phospho -tag分析中分辨率較差板鬓，結(jié)果不太可信 】悲敷；并且C-MAPKKK5不管有無(wú)flg22都能自發(fā)磷酸化，而C-MAPKKK5^K375M展示出被flg22激發(fā)的磷酸化【這里我覺(jué)得他扯淡俭令，可能b圖最后一個(gè)的第一條泳道有兩條帶的原因是被其他激酶加了磷酸基團(tuán)后德，即使沒(méi)有被處理】；N端的磷酸化顯示磷酸化不依賴于flg22處理(圖1B)抄腔。flg22瓢湃，chitin，elf18和pep2都能誘導(dǎo)C-MAPKKK5^K375M和C-MAPKKK5^K243M條帶遷移赫蛇，揭示MAPKKK5可能被各種PRRs激活(圖1CD)绵患。【條帶大小不一可能由于加的磷酸基團(tuán)的數(shù)量不一樣悟耘，不用全長(zhǎng)做是因?yàn)樵趐hos-tag里面全長(zhǎng)的遷移不受flg22的影響藏雏，不知道他這里的K243M是哪里得到的，通篇沒(méi)有介紹】

Figure 1. Patterns Trigger MAPKKK35 Phosphorylation-1.png

MAPKKK3/5 Are Required for MPK3/6 Activation Triggered by Multiple Patterns

Figure 2. MAPKKK3 and MAPKKK5 Regulate Pattern-Induced MAPK Activation-1.png

Figure 2. MAPKKK3 and MAPKKK5 Regulate Pattern-Induced MAPK Activation-2.png

與野生型(Col-0)幼苗相比，mapkkk5突變體中由flg22觸發(fā)的MPK3/6活性略有降低掘殴，而由chitin赚瘦、elf18和pep2觸發(fā)的MPK3/6活性則完全正常(圖2A和圖2B)。不管使用哪種elicitor奏寨，在mapkkk3突變體中MPK3/6的激活不受影響起意。因?yàn)镸APKKK3和5是高度同源的，在雙突(mapkkk3 mapkkk5)中我們發(fā)現(xiàn)病瞳，與Col-0相比揽咕，flg22誘導(dǎo)的MPK3/6的激活減少了大約55%，而chitin套菜、elf18亲善、pep2誘導(dǎo)的MPK3/6的激活減少了80%-90%(F2F-2I)【也就是單突差異不大的時(shí)候做多突】。這些結(jié)果揭示了在面對(duì)各種elicitor的時(shí)候逗柴，需要MAPKKK3/5來(lái)誘導(dǎo)MPK3/6的激活蛹头。在我們測(cè)試的這些PRRs中，包括FLS2戏溺、EFR渣蜗、CERK1、PEPRs旷祸，都通過(guò)MAPKKK3/5來(lái)激活MPK3/6耕拷。

MAPKKK3/5 Are Required for Pattern-Triggered Defense Gene Expression and Disease Resistance

Figure 3. MAPKKK35 Are Required for Defense Gene Expression and Disease Resistance-1.png

Figure 3. MAPKKK35 Are Required for Defense Gene Expression and Disease Resistance-2.png

早先有人報(bào)道，MAPK信號(hào)可以調(diào)節(jié)FRK1(FLG22-INDUCED RECEPTOR KINASE1)的轉(zhuǎn)錄水平托享。在雙突(mapkkk3 mapkkk5)中,在用不同的elcitors處理時(shí)骚烧，如flg22，chitin闰围，elf18止潘，pep2，與WT相比辫诅，轉(zhuǎn)錄水平下降了27-70%凭戴，并且具有顯著差異，ligand各自受體做陽(yáng)性對(duì)照(F3A)炕矮。并且對(duì)雙突接病后發(fā)現(xiàn)3-4倍的細(xì)菌生長(zhǎng)和2倍多的真菌病斑長(zhǎng)(F3B么夫、3C)，這些結(jié)果也與圖2F-2I的MAPK的激活減少聯(lián)系起來(lái)【盡管我覺(jué)得這里的時(shí)間對(duì)應(yīng)不上肤视，一個(gè)是10min档痪，一個(gè)是3d】，揭示了需要MAPKKK3/5來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌和真菌的抗性邢滑。

RLCK VII-4 Subfamily Members Link PRRs to MAPKKK5

Figure 4. RLCK VII Subfamily Members Link PRRs to MAPKKK5-1.png

Figure 4. RLCK VII Subfamily Members Link PRRs to MAPKKK5-2.png

RLCK VII這個(gè)家族包含46個(gè)成員攘乒，在PTI中發(fā)揮重要作用，然而單敲BIK1或家族的其他成員對(duì)于MAPK的激活卻沒(méi)有影響窃诉。早先有人報(bào)道AvrAC是一種專門針對(duì)多個(gè)RLCK VII亞家族成員的尿苷基轉(zhuǎn)移酶，它可以阻止flg22觸發(fā)的MAPK激活衬廷。接下來(lái)我們想知道，MAPKKK5的磷酸化是否由RLCK VII家族的成員來(lái)完成汽绢。在原生質(zhì)體中表達(dá)AvrAC-flag抑制了flg22激發(fā)的C-MAPKKK5^K375M的磷酸化(F4A)吗跋，揭示了特定的RLCK VII成員主導(dǎo)了elicitor介導(dǎo)的MAPKKK5的磷酸化。接下來(lái)我們想通過(guò)雙熒光素酶互補(bǔ)試驗(yàn)來(lái)篩選與MAPKKK5互作的蛋白宁昭，因?yàn)镸APKKK5能誘發(fā)煙草的細(xì)胞死亡跌宛，因此我們使用kinase-dead 突變體MAPKKK5^K375M來(lái)完成。MAPKKK5^K375M與某些的RLCK VII成員互作积仗，但是不包括BAK1疆拘，因此MAPKKK5與RLCK VII的大多數(shù)成員都互作(F4B)。

接下來(lái)用了rlck vii-4六突寂曹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在原生質(zhì)體中chitin激發(fā)的C-MAPKKK5^K375M磷酸化減少了25%哎迄，而flg22激發(fā)的C-MAPKKK5^K375M磷酸化并未受影響，因此RLCk VII-4特定的介導(dǎo)了chitin激發(fā)的MAPKKK5的磷酸化稀颁。在pbl27突變體中芬失，C-MAPKKK5^K375M仍被磷酸化(F4C)楣黍，因此說(shuō)明是RLCk VII-4匾灶，而不是PBL27，參與了chitin激發(fā)的MAPKKK5的磷酸化和MAPK的激活租漂。

接下來(lái)通過(guò)LC-MS鑒定MAPKKK5磷酸化位點(diǎn)阶女，C端有三個(gè)，Ser-599, Ser-682, and Ser-692哩治，其中Ser-599在其他物種和MAPKKK3中也是保守的秃踩。然后開始在雙突中(mapkkk3/5)做轉(zhuǎn)基因的回補(bǔ)材料(都是native promoter驅(qū)動(dòng))，empty vector(EV)业筏，MAPKKK5-HA憔杨，phospho-dead MAPKKK5^S599A，MAPKKK5^s682/692A(2A)蒜胖，模擬磷酸化MAPKKK5^S599D(S599D)消别、MAPKKK5^s682/692E(2E)。

為了查明MAPKKK5的磷酸化是否發(fā)生在這三個(gè)位點(diǎn)台谢，我們制作了分別識(shí)別這三個(gè)位置磷酸化的抗體寻狂。在沒(méi)有被誘導(dǎo)的樣本中沒(méi)有檢查到信號(hào)，在chitin處理的樣本中在這三個(gè)位點(diǎn)檢查到較強(qiáng)的信號(hào)朋沮，在MAPKKK5^S599A和MAPKKK5^s682/692A(2A)卻沒(méi)有檢查到(F4DE)蛇券。這些結(jié)果說(shuō)明，chitin激發(fā)MAPKKK5這三個(gè)位點(diǎn)的磷酸化。PBL19作為RLCk VII-4的一個(gè)成員纠亚，我們想測(cè)試一下是否PBL19能磷酸化MAPKKK5塘慕，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有CERK1和PBL19同時(shí)存在時(shí)菜枷，MAPKKK5才被磷酸化(F4F)苍糠。

Phosphorylation of MAPKKK5 at Ser-599 Is Required for MAPK Activation and Disease Resistance

Figure 5. Phosphorylation of MAPKKK5 at Ser-599 Is Required for MPK36 Activation and Disease Resistance-1.png

Figure 5. Phosphorylation of MAPKKK5 at Ser-599 Is Required for MPK36 Activation and Disease Resistance-2.png

我們?cè)趍apkkk3 mapkkk5雙突的回補(bǔ)材料(EV,MAPKKK5,MAPKKK5^S599A,MAPKKK5^S599D)中用chitin處理來(lái)看Ser-599位置的磷酸化對(duì)激活MPKs的作用。MAPKKK5,MAPKKK5^S599D的回補(bǔ)突變體材料展示出3.5倍左右的MPK3/6的激活啤誊，也就是只回補(bǔ)MAPKKK5能恢復(fù)雙突表型(F5A)岳瞭。【這里奇怪的是蚊锹，雙突中用單基因回補(bǔ)瞳筏，幾乎回復(fù)表型，但是在單基因突變體中差異卻不是很大】而MAPKKK5^S599A在面對(duì)chitin的反應(yīng)與EV類似牡昆，揭示Ser-599的磷酸化對(duì)MAPKKK5的激活很重要姚炕。MAPKKK5^S599D在沒(méi)有chitin存在時(shí)不會(huì)有MPK3/6的激活，提示激活MAPKKK5需要Ser-599的磷酸化丢烘，僅599位的磷酸化還不足以激活MPK3/6柱宦。總之播瞳，這些結(jié)果說(shuō)明RLCk VII-4家族的成員能夠直接磷酸化Ser-599來(lái)正調(diào)節(jié)chitin激發(fā)的MAPKKK5的激活掸刊。接下來(lái)?yè)Q做flg22處理，發(fā)現(xiàn)赢乓，MAPKKK5^S599A在面對(duì)flg22的反應(yīng)與EV類似忧侧，MAPKKK5與MAPKKK5^S599D的反應(yīng)類似(F5B)。上述結(jié)果說(shuō)明牌芋，在flg22激發(fā)的MPK3/6的激活中蚓炬，Ser-599的磷酸化也很重要。并且暗示其他的RLCk VII成員也通過(guò)磷酸化Ser-599來(lái)調(diào)節(jié)flg22激發(fā)的MAPKKK5的激活躺屁。

接下來(lái)肯夏，就想看一下flg22和chitin處理對(duì)FRK1轉(zhuǎn)錄水平的影響。MAPKKK5和MAPKKK5^S599D展示出最高的FRK1的轉(zhuǎn)錄水平(F5CD)犀暑。并且不管接細(xì)菌病害丁香假單胞菌還是真菌病害灰葡萄菌都顯示出類似的結(jié)果(F5EF)驯击。因此說(shuō)明MAPKKK5 Ser-599的磷酸化對(duì)抗病性的產(chǎn)生很重要。

MPK6 Phosphorylates MPKKK5 at Ser-682/692

Figure 6. MPK6 Phosphorylated MAPKKK5 at Ser-682 and Ser-692.png

預(yù)測(cè)得知母怜，MPKKK5的Ser-682, and Ser-692位點(diǎn)是MAPK磷酸化的motif余耽。體外磷酸化試驗(yàn)表明，GST-MAPKKK5-T與MPK6孵育在Ser-682, and Ser-692處有弱的磷酸化苹熏。加入MKK5的組成型激活形式-MKK5DD碟贾，導(dǎo)致了Ser-682, and Ser-692的強(qiáng)磷酸化币喧，揭示MPK6能直接磷酸化Ser-682, and Ser-692這兩個(gè)位點(diǎn)。過(guò)表達(dá)全長(zhǎng)MAPKKK5可導(dǎo)致擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞死亡袱耽，難以獲得足夠數(shù)量的MAPKKK5蛋白來(lái)進(jìn)行磷酸化檢測(cè)杀餐。因此，我們檢測(cè)條件型mpk3 mpk6雙突變體【mpk3 mpk6 P_MPK6:MPK6^YG (MPK6SR)】原生質(zhì)體中的MAPKKK5-T磷酸化朱巨。該突變體被MPK6^Y144G所恢復(fù)史翘，擴(kuò)展了ATP的結(jié)合口袋，對(duì)ATP激酶的抑制劑NA-PP1敏感冀续。NA-PP1的加入特異性地抑制了MPK6SR原生質(zhì)體中Ser-682和Ser-692的磷酸化(圖6B)琼讽，支持了MPK6介導(dǎo)植物細(xì)胞中模式觸發(fā)的Ser-682/692磷酸化的觀點(diǎn)。在col-0中洪唐，不經(jīng)chitin處理钻蹬，我們檢測(cè)到Ser-682的磷酸化而沒(méi)有Ser-692的(F6C)，在rlck vii-4的突變體原生質(zhì)體中凭需，Ser-682磷酸化減少问欠，Ser-692的磷酸化被破壞。這些結(jié)果表明粒蜈，RLCK VII-4亞家族成員是植物細(xì)胞中由chitin觸發(fā)的Ser-682/692磷酸化所必需的顺献，這與在rlck vii-4中MPK6活化減少的觀點(diǎn)是一致的。

Phosphorylation of MAPKKK5 at Ser-682/692 Enhances MPK3/6 Activation and Immunity

Figure 7. Phosphorylation of MAPKKK5 Ser-682692 Enhances MPK36 Activation and Immunity-1.png

Figure 7. Phosphorylation of MAPKKK5 Ser-682692 Enhances MPK36 Activation and Immunity-2.png

分別用chitin和flg22處理回補(bǔ)突變體的時(shí)候發(fā)現(xiàn)枯怖，與MAPKKK5相比注整，在經(jīng)過(guò)chitin和flg22處理后，MAPKKK52A中MPK3/6激活程度略有下降嫁怀，而MAPKKK52E中MPK3/6激活程度高于MAPKKK5(圖7A和7B)设捐，說(shuō)明完全激活MAPKKK5需要Ser-682/692的磷酸化借浊。 與Col-0相比塘淑，MAPKKK52E幼苗表現(xiàn)出更大的MPK3/6激活(圖7C)，表明Ser-682/692磷酸化正調(diào)控對(duì)MPK3/6的激活蚂斤。在mapkkk3 mapkkk5突變體的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)MAPKKK52E存捺，與轉(zhuǎn)染MAPKKK5相比，顯示出增強(qiáng)的chitin激發(fā)的MPK3/6的激活曙蒸，瞬時(shí)表達(dá)MAPKKK5^{S599D捌治，2E}并沒(méi)有進(jìn)一步增強(qiáng)chitin引發(fā)的MPK3/6的激活，也沒(méi)有導(dǎo)致MPK3/6的組成型激活(圖7D)纽窟。

與完全恢復(fù)的MAPKKK5相比肖油，MAPKKK52A細(xì)胞系部分恢復(fù)了FRK1的表達(dá)，而MAPKKK52E表現(xiàn)出更強(qiáng)的FRK1表達(dá)(圖7E和圖7F)臂港，說(shuō)明Ser-682/692 磷酸化正向調(diào)節(jié)flg22和chitin觸發(fā)的免疫反應(yīng)森枪。接著接病處理视搏，丁香假單胞菌和灰霉葡萄菌，呈現(xiàn)出與上述相同的結(jié)果(F7GH)說(shuō)明县袱，磷酸化的Ser-682/692能同時(shí)增強(qiáng)對(duì)細(xì)菌和真菌的抗性浑娜。【682/692的磷酸化是MPK6的作用式散，而599是RLCK的作用】

MEKK1 Is Phosphorylated by Both RLCK VII-4 and MPK4

Figure 8. Both RLCK VII-4 and MPK4 Phosphorylate MEKK1 at Ser-603-1.png

Figure 8. Both RLCK VII-4 and MPK4 Phosphorylate MEKK1 at Ser-603-2.png

接下來(lái)我們想看是否MEKK1也被相似的通路調(diào)控(PRR-RLCK VII-MAPKKK5)筋遭。使用summ2-8 mekk1突變體，因?yàn)镾UMM2(一種NLR)監(jiān)視MEKK1-MKK1/2-MPK4通路暴拄，當(dāng)這條通路被破壞時(shí)漓滔，會(huì)激活免疫反應(yīng)。

檢測(cè)一個(gè)kinase-dead的C端MEKK1片段(C-MEKK1K361M-HA)【在ATP結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生Lys361Met突變】乖篷，用flg22次和、elf18和chitin處理原生質(zhì)體后，SDS-PAGE上出現(xiàn)了磷酸酶敏感性的遷移率變化(圖8A)那伐，表明MEKK1是由模式觸發(fā)的磷酸化踏施。LC-MS鑒定磷酸化位點(diǎn)，替換Ser-603(但不包括其他四個(gè)殘基)到Ala導(dǎo)致了chitin-或flg22誘導(dǎo)的C-MEKK1K361M條帶遷移消失(圖8B)罕邀，說(shuō)明Ser-603在模式觸發(fā)的MEKK1磷酸化過(guò)程中是一個(gè)主要的磷酸化位點(diǎn)畅形。對(duì)照樣品中未檢測(cè)到信號(hào)，但chitin處理樣品中檢測(cè)到MEKK1中Ser-603位點(diǎn)磷酸化的強(qiáng)信號(hào)(圖8C)诉探。這些結(jié)果證實(shí)了chitin確實(shí)能夠觸發(fā)MEKK1在Ser-603位點(diǎn)的磷酸化日熬。上述磷酸化特異性抗體特異性檢測(cè)到chitin觸發(fā)C-MEKK1K361M的磷酸化，而不是C-MEKK1K361M/S603A(圖8D)肾胯。

與summ2-8相比竖席，在summ2-8 mpk4中，chitin和flg22誘導(dǎo)的的MEKK1磷酸化減少(圖8f)敬肚。此外毕荐，從原生質(zhì)體中純化得到的MPK4- flag蛋白可使GST-MEKK-T重組蛋白在Ser-603位點(diǎn)磷酸化(圖8G)，表明MPK4可直接磷酸化Ser-603位點(diǎn)的MEKK1艳馒。

Phosphorylation of MEKK1 at Ser-603 Is Required for MPK4 Activation and the Suppression of Autoimmunity

Figure 9. Phosphorylation of MEKK1 at Ser-603 Is Required for the Activation of MPK4 and the Suppression of Autoimmunity-1.png

Figure 9. Phosphorylation of MEKK1 at Ser-603 Is Required for the Activation of MPK4 and the Suppression of Autoimmunity-2.png

如圖9A和9B所示憎亚，與野生型MEKK1轉(zhuǎn)化的植株相比，在MEKK1S603A系中弄慰，flg22和chitin誘導(dǎo)的MPK4活化減少第美，說(shuō)明MEKK1的活化需要Ser-603磷酸化。我們接著在mekk1突變體中陆爽，想知道Ser-603磷酸化是否是SUMM2介導(dǎo)的自身免疫修復(fù)所必需的什往。我們?cè)趍ekk1背景下產(chǎn)生了5個(gè)MEKK1和5個(gè)MEKK1S603A轉(zhuǎn)基因株系。在所有MEKK1轉(zhuǎn)化的植株中慌闭，矮化表型均得到完全恢復(fù)(圖9C和9D)别威。

model圖我就不解釋了第献，我剖析的比較透徹且畫的比較詳細(xì)了。
證明思路

1.在面對(duì)多種pattern處理時(shí)兔港，MAPKKK3/5 被磷酸化庸毫。

2.在各種pattern處理后，MAPKKK3/5能激活 MAPKKK3/5衫樊。

3.在各種pattern處理后飒赃，MAPKKK3/5能激活防衛(wèi)基因的表達(dá)并能增強(qiáng)抗病性。2與3也就形成了MAPKKK3/5-MAPKKK3/5-防衛(wèi)基因這條通路科侈。

4.接著通路往上游做载佳，RLCK VII-4家族將PRRs和MAPKKK5聯(lián)系起來(lái)，并且只參與chitin處理后的信號(hào)通路臀栈。

5.再找磷酸化的位點(diǎn)蔫慧，發(fā)現(xiàn)MAPKKK5 599位的Ser磷酸化對(duì)于激活MAPK和行使抗病性是必要的。關(guān)鍵位點(diǎn)最好是在物種和其他基因都保守权薯。

6.MPK6能磷酸化MPKKK5 682/692位的Ser姑躲，形成一個(gè)正向的loop。

7.發(fā)現(xiàn)MAPKKK5 682/692位的Ser磷酸化對(duì)于激活MPK3/6和免疫發(fā)生是必要的盟蚣。

8.MEKK1也被RLCK VII-4和MPK4所磷酸化黍析。

9.MEKK1 603-Ser的磷酸化對(duì)于MPK4的激活和抑制自發(fā)免疫也很重要。