熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù) (real-time quantitative PCR，qPCR) 幾乎是現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)中最重要、應(yīng)用最廣泛的核酸定量檢測技術(shù)依啰。成功的定量 PCR 實(shí)驗(yàn)離不開精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作流程丹拯。
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析的部分實(shí)施需要經(jīng)過優(yōu)化以確保所有反應(yīng)參數(shù)均設(shè)置精確，從而獲得準(zhǔn)確的結(jié)果企锌。常見熒光定量 PCR 困難包括引物、探針于未、反應(yīng)抑制和軟件分析等幾個(gè)方面撕攒，本篇主要為大家分享引物和探針方面的經(jīng)驗(yàn)。
引物二聚體
引物二聚體的形成是最常見的問題之一烘浦。引物對之間的部分序列存在同源性時(shí)抖坪，可形成引物二聚體。如果在 PCR 反應(yīng)過程中引物退火形成二聚體闷叉，則 Taq DNA 聚合酶可延伸二聚體擦俐，形成長于原始引物的產(chǎn)物，它可導(dǎo)致循環(huán)過程中更易出現(xiàn)退火錯(cuò)誤片习。
Q：引物二聚體會引發(fā)什么問題捌肴？
引物二聚體對反應(yīng)的影響在很大程度上取決于反應(yīng)中采用的化學(xué)物質(zhì)∨河剑基于熒光探針的反應(yīng)受引物二聚體的影響不是很大状知，這是由于在引物二聚體區(qū)域極少出現(xiàn)探針退火及斷裂的現(xiàn)象。此時(shí)孽查，引物的競爭作用是需要考慮的主要問題饥悴。基于雙鏈 DNA 結(jié)合染料的反應(yīng)受引物二聚體的影響很大盲再，由于染料的結(jié)合方式為非特異性的西设，由此可導(dǎo)致反應(yīng)過程中監(jiān)測到的熒光信號增強(qiáng)。這可相應(yīng)改變 Ct 值答朋，使結(jié)果出現(xiàn)偏差贷揽。
Q：怎樣確定是否存在引物二聚體？
凝膠電泳是顯示引物二聚體的一種極佳的方法梦碗。引物二聚體在凝膠的底部形成擴(kuò)散條帶禽绪，通常位于 100 bp 以下蓖救。單獨(dú)采用凝膠電泳分析進(jìn)行驗(yàn)證的缺點(diǎn)在于，其靈敏度最低僅達(dá)到納克級印屁，因此可能無法得出結(jié)果循捺。
熔解曲線也是一種顯示引物二聚體的放法。如果擴(kuò)增具有極好的特異性雄人，則實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 板上每個(gè)反應(yīng)孔的解離曲線將出現(xiàn)一個(gè)較窄的單峰从橘。引物二聚體的熒光強(qiáng)度較低，呈較寬的「波形」础钠，顯示其在 70 °C 左右熔解（見圖1.）恰力。
圖 1. 熔解曲線中突出顯示了引物二聚體效應(yīng)
Q：怎樣設(shè)計(jì)和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)避免出現(xiàn)引物二聚體？
最好在引物設(shè)計(jì)階段就采取簡單的預(yù)防措施旗吁，從一開始即避免二聚體的形成牺勾。如果出現(xiàn)了引物二聚體，有許多方法可以減少或消除反應(yīng)中的引物二聚體阵漏。
- 首先是優(yōu)化熱循環(huán)條件，這主要是提高退火溫度翻具。大多數(shù)情況下履怯，兩步循環(huán)（由 95 °C 變性步驟直接進(jìn)入 60 °C 退火和延伸步驟）有利于強(qiáng)效擴(kuò)增，因此引物設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)定的成功退火溫度為 60 °C裆泳。
- 可降低引物濃度叹洲，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的幫助。大多數(shù)情況下工禾，每條引物的理想最終濃度為 200 nM运提，但如有需要，可將濃度降至 60 nM闻葵。
- 鎂的最佳濃度一般約為 3 mM民泵。高于此濃度易形成引物二聚體。
- 如果未對引物形成二聚體的傾向進(jìn)行評估槽畔，則應(yīng)補(bǔ)充評估并考慮重新設(shè)計(jì)（如有需要）栈妆。通常情況下，最好使用熱啟動 DNA 聚合酶厢钧，并在冰上進(jìn)行反應(yīng)鳞尔。
- 在理論上，針對同一靶點(diǎn)應(yīng)同時(shí)檢測多個(gè)引物組早直。這實(shí)際上可以節(jié)省大量時(shí)間寥假，因?yàn)槿绻@些引物中的一個(gè)能立即發(fā)揮作用，則可以減少花費(fèi)在優(yōu)化過程上的時(shí)間霞扬。
引物和探針的儲存
引物和探針儲存不當(dāng)可導(dǎo)致降解及特異性喪失糕韧，進(jìn)而對反應(yīng)效率造成影響枫振。影響引物和探針的穩(wěn)定性的主要因素是儲存溫度、儲存時(shí)間兔沃、是否被長時(shí)間曝光蒋得、儲存的引物和探針的濃度以及儲存溶液的組分。
Q：如何長期保持引物和探針的穩(wěn)定性乒疏？
保持引物和探針的穩(wěn)定性的關(guān)鍵有四點(diǎn)额衙。低壓凍干的引物在儲存時(shí)間和溫度方面具有更好的靈活性。引物一旦重新溶解怕吴，即應(yīng)置于 -20 °C 保存窍侧，且若保存時(shí)間超過一年則應(yīng)對其進(jìn)行監(jiān)測，看它是否出現(xiàn)功能下降转绷。對于標(biāo)記的引物和探針伟件，則應(yīng)采取措施避免標(biāo)記物曝光（例如使用不透明管及置于暗處保存），以延長它們的使用壽命议经。
引物濃度也可影響其穩(wěn)定性斧账。建議引物的儲存濃度不低于 10 μM；實(shí)際上煞肾，在大多數(shù)情況下咧织，100 μM 的引物濃度操作更簡單。引物和探針還應(yīng)分裝保存籍救，以減少凍融次數(shù)习绢，特別是標(biāo)記的引物和探針。最后蝙昙，TE 緩沖液可形成比水更為穩(wěn)定的環(huán)境闪萄。此外，含有 0.1 mM EDTA 的 TE 緩沖液（標(biāo)準(zhǔn) TE 中含有 1 mM EDTA）是一種理想的溶液奇颠，這是由于一些 PCR 反應(yīng)對 EDTA 的靈敏度可能有一些殘存败去。
NTC 擴(kuò)增
當(dāng)引物二聚體形成時(shí)，如果使用與 DNA 雙鏈結(jié)合的染料大刊，在 NTC 反應(yīng)中也可觀察到熒光信號为迈。也存在另一種情況，在存在污染物的情況下缺菌，無論是基于探針還是雙鏈 DNA 結(jié)合染料的反應(yīng)葫辐，引物二聚體的擴(kuò)增也會在 NTC 孔中被觀察到。這可能是一種隨機(jī)事件伴郁，并不是所有 NTC 都會出現(xiàn)擴(kuò)增耿战，通常是由不常見的加樣錯(cuò)誤引起。如果在每一個(gè) NTC 反應(yīng)里都出現(xiàn)擴(kuò)增焊傅，很可能是其中一種或兩種試劑被污染了剂陡。
Q：如何防止或去除污染狈涮？
- 使用干凈的工作臺，用帶核酸降解試劑的的溶液擦抹工作臺面鸭栖。
- 用帶 dUTP 和 UDG 的反應(yīng)預(yù)混液降解來自前序 PCR 反應(yīng)的產(chǎn)物歌馍，防止前序 PCR 反應(yīng)的污染。
- 用新的反應(yīng)管盡量通過置換不同來源的試劑晕鹊，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)問題的試劑松却。
- 在條件允許的情況下，在不同的實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)建立反應(yīng)溅话，尤其是當(dāng)應(yīng)用質(zhì)粒作為對照時(shí)（質(zhì)料停可以被很容易擴(kuò)散并且難以去掉）。
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析優(yōu)化過程確實(shí)需要時(shí)間飞几，但是所花的時(shí)間是值得的砚哆。這樣得出的分析結(jié)果不僅具有最高的靈敏度和最大的動態(tài)范圍，而且準(zhǔn)確度高屑墨、效率高躁锁、重復(fù)性好，為實(shí)驗(yàn)提供可靠的數(shù)據(jù)卵史。
