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陳巍學基因視頻學習筆記--視頻1：Illumina測序化學原理
RNA-seq的應用
- 檢測所有mRNA的表達量的差異踩身；
- 檢測RNA結構差異：可變剪接胀茵、融合基因、基因但點突變導致的SNP
第一部分：RNA-seq測序方法
1. 去除核糖體RNA（由于rRNA非常保守挟阻，極度穩(wěn)定琼娘，提供不了有用的信息）
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illumia公司的Truseq RNA建庫方法
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Ploy A尾mRNA和PolyT探針結合，回收磁珠附鸽，將mRNA從磁珠洗脫后用鎂離子溶液打斷脱拼；被打斷的片段用隨機引物進行逆轉錄成cDNA，再合稱為雙鏈cDNA坷备，在雙鏈cDNA兩端接上Y型接頭
2. 對mRNA的完整度要求較高
由于PolyT探針只能結合PolyA尾熄浓，如果mRNA發(fā)生斷裂（不完整），那么PolyT脫下來的PloyA mRNA則不完整省撑，造成測序數據的偏差赌蔑。
因此在測序前需要對總RNA的質量進行質檢
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28S，18S峰越高越尖越好
RIN：RNA integrity number竟秫，0-10分娃惯，RIN在8.0以上是illumia公司推薦的標準。
第二部分：RNA-seq測序數據分析
- RNA mapping到基因組上
- RNA完整度
下圖顯示mRNA的完整度
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RNA表達量分析：RPKM等等
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某基因被測到的read數除以全部可比對到基因組上的read數 （容易理解）
為什么還要除以外顯子長度鸿摇？
因為外顯子越長石景，被鎂離子打斷出來的片段就越多，因此需要修正mRNA長度引起的read的偏差。 火山圖等整體差異分析結果
聚類分析
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GO分析
Gene Ontology：基因功能分類體系
GO：參與的生物學過程潮孽；基因產物的功能揪荣；基因產物在細胞中的空間定位。
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KEGG京東基因和基因組百科全書
不詳細介紹圖怎么看往史。
image.png RNA結構變異
（1）可變剪接：建議測序深度較深仗颈，10G以上（二代測序測長不夠長，是零碎狀態(tài)）
（2）融合基因
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（3）點突變造成的SNP
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