三十六策 第 12 策 革故鼎新
篩荷愕、猜 幾個分子额获，表型驗證一下装畅，按照套路把表達差異柜某、一正一反嗽元、細胞動物一做
查 lncRNA 序列也有一個權(quán)威數(shù)據(jù)庫叫 [noncode](file:///Users/gaoyuan/Desktop/%E4%B8%89%E5%8D%81%E5%85%AD%E7%AD%96/www.noncode.org)敛纲，在做研究的時候就要先進行序列分析，證明它不編碼蛋白
ORF 開放閱讀框：從起始密碼子開始到終止密碼子剂癌，一段連續(xù)能編碼氨基酸的核酸序列淤翔，（分辨一段序列是不是非編碼，就是看它有沒有超過 100 個堿基長度的 ORF）
還有一種分析非編碼 RNA 序列特性的工具叫 CSF密碼子替換頻率佩谷，主要是看一段序列編碼的密碼子在不同物種之間的保守性办铡。當 CSF 評分小于 0 的時候，就可以認為他是一個非編碼
研究 lncRNA 的前置動作也是篩猜分子
找一些有過報道的 lncRNA 分子琳要，序列寡具，引物，siRNA 都是現(xiàn)成的稚补，把所有的關(guān)注點聚焦到分子是不是有新表型上童叠。
lncRNA命名混亂
反義 AS： 反義是一類從編碼基因反向轉(zhuǎn)錄的 lncRNA
內(nèi)含子 IT： 在基因內(nèi)含子區(qū)域編碼的 lncRNA。
重疊 OT：是跨越內(nèi)含子和外顯子的 lncRNA课幕。
長鏈基因間 lncRNA lincRNA厦坛，都是以大寫 LINC 為前綴數(shù)字為后綴，編碼區(qū)域位于兩個基因中間乍惊，不與編碼基因的內(nèi)含子和外顯子重疊杜秸。
與編碼基因是頭對頭挨著，推斷有雙向啟動子润绎，這些 lncRNA 用反義上游 AU做后綴
eRNA撬碟，是由基因的增強子編碼產(chǎn)生的，作用是促進基因轉(zhuǎn)錄莉撇。
circRNA 是由特殊可變剪切產(chǎn)生的呢蛤，主要存在于細胞質(zhì)中，大部分來源于外顯子棍郎，少部分內(nèi)含子來源的 circRNA 存在細胞核中其障。circRNA 因為呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被核酸外切酶降解涂佃， 比線性 RNA 更加穩(wěn)定励翼。circRNA 的表達水平具有種屬、組織辜荠、時間特異性汽抚，序列保守性比一般的線性 lncRNA 高。
篩分子侨拦，找序列殊橙，基礎(chǔ)表達，操作工具狱从，細胞表型膨蛮， 動物表型和 Rescue。
第一步季研，檢測基礎(chǔ)表達做 RNA 水平檢測敞葛，實時定量 RT-PCR。 還可以FISH与涡，熒光原位雜交
第二步惹谐，制備基因操作工具，核定位的 lncRNA 用 RNAi 做可能效果是很差驼卖，CRISPR 基因編輯技術(shù)直接把 lncRNA 的基因給 knockout 掉
第三步氨肌，細胞表型實驗
第四步，動物表型實驗
第五步酌畜，表型的 Rescue 實驗怎囚，把 CRISPR 敲掉后的細胞再過表達 lncRNA 分子進去。
因為一正一反的兩次操作被合并到一個實驗里觀察桥胞，其他的干擾因素都沒有恳守，只有觀察到分子上調(diào)或下調(diào)后表型出現(xiàn)或失去，這種因果關(guān)系的證明就更強了贩虾。單變量的 Rescue 實驗可以替代一正一反催烘，但是一正一反兩個實驗不能替代 Rescue。
功能基因的 Rescue 利用密碼子的簡并性導入一個突變過表達載體缎罢， 可以使得過表達和 siRNA 干擾這兩個操作相互獨立伊群。序列人為突變之后，讓蛋白的氨基酸序列保持不變策精，而 mRNA 序列可以發(fā)生改變在岂，變得 siRNA 結(jié)合不上也就阻斷不了了。這樣的 rescue 效果是分子介導的功能表型之間發(fā)生抵消作用蛮寂，而不是 siRNA 跟過表達載體的相互結(jié)合蔽午、無效化。
miRNA 作用于靶基因 mRNA 的 3’UTR酬蹋，但是做下游靶基因的過表達的時候及老，只需要把 ORF 開放閱讀框克隆到載體里面，不加 3’-UTR范抓，轉(zhuǎn)進入的 Rescue 載體不受 miRNA 過表達的影響骄恶。如果表型回復成功了，就說明 miRNA 的表達和表型的關(guān)聯(lián)是依賴于這個靶蛋白變化的匕垫。如果表型沒變化僧鲁，那就說明 miRNA 介導表型不是靠這個蛋白。
Rescue 就是這樣一種證明一個分子發(fā)揮功能依賴于另一個分子的實驗策略
lncRNA，circRNA 的作用機制
第一寞秃，它可以作為 miRNA 分子海綿斟叼，像海綿一樣吸引結(jié)合 miRNA。
第二春寿，它可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄朗涩，跟轉(zhuǎn)錄因子關(guān)系密切。
第三绑改，編碼小肽谢床。
