? ? 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR谢床，簡稱 RT-QPCR, 屬于 Q-PCR 的一種，目前該技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用洲赵，如：擴(kuò)增特異性分析鸳惯、基因定量分析商蕴、基因分型、 SNP 分析等芝发。熒光定量 PCR 常用的方法是 DNA 結(jié)合染料 SYBR GreenⅠ的非特異性方法绪商。

? ? SYBR Green I 是一種結(jié)合于所有 dsDNA 雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的熒光染料， 可與所有的各種序列的雙鏈 DNA 分子結(jié)合辅鲸。 在游離狀態(tài)下格郁，SYBR Green I 發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈 DNA 結(jié)合瓢湃， 嵌入至 dsDNA，熒光大大增強(qiáng)赫蛇。

? ? 因此绵患， SYBR Green I 的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈 DNA 的數(shù)量相關(guān)， PCR 擴(kuò)增不同時(shí)期中悟耘， dsDNA 含量不同落蝙， SYBR Green I 熒光信號(hào)強(qiáng)度不同。 可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量暂幼， 并可根據(jù)對照進(jìn)行相關(guān)的計(jì)算和分析筏勒。

1.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)開始前，需準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)所需的各種試劑和耗材旺嬉。

試劑包括：特異性 PCR 引物管行，新鮮提取備用的總 RNA。

使用的試劑盒有：用于合成 cDNA 第一鏈的羅氏試劑盒 Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit邪媳，包含了 cDNA 反應(yīng)所需要的所有實(shí)驗(yàn)組分以及相關(guān)的正對照反應(yīng)組分捐顷。

配套 LightCycler? 480 使用的試劑盒 LightCycler? 480 SYBR Green I Master，包含了 PCR 所需的各種實(shí)驗(yàn)組分雨效，如 1 號(hào)管中包含熱啟動(dòng) Taq DNA Polymerase及反應(yīng)緩沖液迅涮， dNTP mix， SYBR Green I 染料和 MgCl2正式試驗(yàn)開始前徽龟，冰上解凍各個(gè)試劑及試劑盒組分叮姑，置于冰上待用。 注意：SYBR Green I Master 需避光放置据悔。

所需儀器與耗材有：羅氏 LightCycler? 480 全自動(dòng)實(shí)時(shí)定量 PCR 儀以及配套使用的 96 或 384 多孔板传透，透明封板膜等一次性耗材。賽默飛公司提供的 Thermo Scientific Arktik PCR 儀极颓、單道移液器旷祸、 Nunc 冰盒及 QSP 盒裝吸頭等。

接下來進(jìn)入實(shí)驗(yàn)部分讼昆，本實(shí)驗(yàn)操作流程是：首先用新鮮提取的 RNA 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈托享，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR骚烧，其中包括： SYBR Green 反應(yīng)體系的配置； PCR 程序設(shè)置闰围； 運(yùn)行 PCR 實(shí)驗(yàn)赃绊，樣品編輯和結(jié)果分析。

2羡榴、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

首先是反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈：

實(shí)驗(yàn)操作時(shí)注意：所有 RNA 相關(guān)的操作均要佩戴手套碧查，防止 RNase 污染。相關(guān)操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說明進(jìn)行相關(guān)操作校仑。

按照體系配方在冰上的 Rnase free 的滅菌 PCR 管中配置 Template primer mix忠售，總體系 13μl，本實(shí)驗(yàn)是聯(lián)合使用 anchored oligo dT 引物和隨機(jī)六聚體引物進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄迄沫。 先配置 NTC 對照稻扬，加入 9 號(hào)管水 10μl、 6 號(hào)管的 50mM oligo dT 引物 1μl羊瘩、 5 號(hào)管的 0.6mM 隨機(jī)六聚體引物 2μl泰佳，混勻。 然后進(jìn)行樣品一號(hào)管的體系配置尘吗， 依次加入 1μl 已調(diào)整濃度的總 RNA逝她、 1μl oligo dT 引物、 2μl 隨機(jī)六聚體引物睬捶、最后加 9μl 水補(bǔ)充至總體積 13μl黔宛，混勻。其他樣品管擒贸，參照 1 號(hào)管的配置方法宁昭，依次加好反應(yīng)體系。注意：可將總 RNA的模板量適當(dāng)調(diào)整至 10ng-5μg酗宋，mRNA調(diào)整至 1-100ng积仗。

若 RNA 樣品濃度較低，則可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 來穩(wěn)定模板 RNA蜕猫。

將配好的反應(yīng) mix 在 PCR 儀中 65℃變性 10min寂曹，可有效減少 RNA 的二級結(jié)構(gòu)。加熱后迅速置于冰上驟冷回右，放置 5min隆圆。在反應(yīng) Template primer mix 中按體系配方順序，依次加入以下試劑： 2 號(hào)管的 5×反轉(zhuǎn)錄酶 buffer翔烁， 4 號(hào)管 dNTP mix渺氧， 3 號(hào)管 40 U/μl 的 RNase 抑制劑， 1 號(hào)管 20 U/μl 的反轉(zhuǎn)錄酶蹬屹，最終體積為 20μl侣背。

若樣品數(shù)較多白华，先配置反應(yīng) mix 再分裝，小心吸打混合贩耐，切勿渦旋振蕩弧腥。混勻后于瞬時(shí)離心機(jī)上短暫離心，使樣品和反應(yīng)液落至離心管底部潮太。將離心管放置 PCR 中管搪，根據(jù)使用的引物以及目標(biāo) mRNA 的片段長度進(jìn)行程序設(shè)置。本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)溫度和時(shí)間設(shè)置為： 25℃铡买， 10min更鲁， 55℃反應(yīng) 30min。反應(yīng)完畢后奇钞，于 85℃下加熱 5min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶澡为， 再置于冰上停止反應(yīng)。此反應(yīng)產(chǎn)物可于 2-8℃存放 1-2h蛇券，或在-15 至-25℃下存放更長時(shí)間缀壤。

3樊拓、Q-PCR 擴(kuò)增

cDNA 產(chǎn)物無需進(jìn)行純化即可用于后續(xù)的 PCR 反應(yīng)纠亚。 20μl 的 PCR 反應(yīng)體系可取 2-5μl cDNA 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。此試劑盒中的反轉(zhuǎn)錄酶具有 RNase H 活性筋夏，可以在 cDNA 合成之后去除 RNA 模版蒂胞，減少其對后續(xù) PCR 的影響。

本部分實(shí)驗(yàn)条篷，我們選用羅氏的 SYBR Green I Master 試劑盒進(jìn)行基礎(chǔ)的絕對定量分析骗随。

本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置 5 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品，包含 1 個(gè)標(biāo)記為 0 的空白對照鸿染， 5 個(gè)反轉(zhuǎn)錄樣品，包含 NTC 對照涨椒，由于樣品數(shù)較多绽媒，先配制不含模版的總體系蚕冬，再分裝為10管，加入各個(gè)樣品的模板后是辕，再將每個(gè)樣品分裝為 3 個(gè)復(fù)孔。

按照體系配方分別加入綠色蓋子的 2×Master Mix获三， 10x Primer 上下游引物锨苏，PCR 級別水。 總體系配好后牌芋，在用移液槍輕柔吸打均勻蚓炬，然后分裝為 10 管，每管 55μl躺屁。往 10 管中分別加入各個(gè)樣品對應(yīng)的調(diào)整好濃度的 cDNA。STD 零加入 6μl 水代替模板驯击，其余 STD 分別加入 6μl 已經(jīng)逐級稀釋好的標(biāo)樣模板。 反轉(zhuǎn)錄樣品分別加入 6μl 濃度調(diào)整好的模板 DNA徊都， 包含 NTC广辰。混勻择吊，然后將每個(gè)樣按 20μl 每孔分裝至 96 孔板中。用封孔膜蓋好 96 孔板房轿，將多孔板置于合適的離心機(jī)中 1500×g 配平離心 2min 將準(zhǔn)備好的 96 孔板放置在LightCycler? 480 設(shè)備中所森。

4、程序設(shè)定

雙擊打開 LightCycler? 480 的 1.5 軟件并登陸，自動(dòng)進(jìn)入軟件界面辑奈，點(diǎn)擊 new experiment,在 Detection Format 選項(xiàng)中選擇 SYBR Green I 模式, 點(diǎn)擊 OK 完成檢測通道的設(shè)定,接下來設(shè)置反應(yīng)體積辙谜，對于 96 模塊肝匆，反應(yīng)體系為 10μl-100μl 之間，本實(shí)驗(yàn)是設(shè)定 20μl 的反應(yīng)體系旗国。

在 Program Name 中輸入反應(yīng)名稱 pre incubation，預(yù)變性設(shè)定 1 個(gè)循環(huán)能曾，無需進(jìn)行熒光的收集肿轨，執(zhí)行的溫度和時(shí)間設(shè)定為 95℃ 10min蕊程，視圖會(huì)根據(jù)設(shè)定進(jìn)行實(shí)時(shí)的調(diào)整。

點(diǎn)擊增加按鈕藻茂，輸入 Amplification，定義擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)為 45 次优俘，并選擇熒光的收集功能 Quantification掀序，然后設(shè)定 PCR 擴(kuò)增循環(huán)的溫度與時(shí)間為 95℃ 10s，點(diǎn)擊增加按鈕不恭，設(shè)定退火溫度和時(shí)間為 60℃ 10s，以上兩步 Acquisition Mode 都默認(rèn)選擇 None折晦，繼續(xù)點(diǎn)擊增加按鈕式散，設(shè)置延伸溫度和時(shí)間為 72℃ 20s打颤，Acquisition Mode 選擇 Single， Ramp Rate 均按自動(dòng)調(diào)整值乖篷，無需再設(shè)置透且。

設(shè)置溶解曲線，在 Program 中的新的一行中輸入 Melting Curves秽誊， 1 個(gè)循環(huán)數(shù)， Analysis Mode 選擇 Melting Curves讼溺，時(shí)間和溫度設(shè)置為 95℃ 5s最易， 點(diǎn)擊增加按鈕炫狱，新增設(shè)置溫度和時(shí)間為 65℃ 1min剔猿，以上兩步 Acquisition Mode 都默認(rèn)選擇 None。點(diǎn)擊增加按鈕酷含，新增設(shè)置溫度為 95℃汪茧，Acquisition Mode 選擇 Continuous,其他設(shè)置無需改動(dòng)。

設(shè)置保溫的過程 Cooling陆爽，只需 1 個(gè)循環(huán)，無需收集熒光别威，設(shè)定溫度和時(shí)間為 40℃驴剔、 1min。設(shè)置完成后點(diǎn)擊右邊的保存按鈕保存設(shè)置的程序丧失。此時(shí)整個(gè) PCR的循環(huán)體系布讹、溫度的設(shè)置已經(jīng)設(shè)定完畢。

點(diǎn)擊 Start run 開始運(yùn)行 PCR 反應(yīng)描验，此時(shí)可在軟件上實(shí)時(shí)監(jiān)測樣品擴(kuò)增情況。

5絮缅、樣品編輯

實(shí)驗(yàn)結(jié)束呼股，點(diǎn)擊 Sample Editor，進(jìn)入樣本編輯區(qū)彭谁。

Select Workflow 中選擇 Abs Quant。根據(jù)樣本在板中排布的方式進(jìn)行樣本編輯奄抽。設(shè)置陰性對照、空白對照额划、標(biāo)準(zhǔn)品以及未知樣品等档泽。

在 Select Sample 中，選中需要設(shè)置的樣品孔馆匿。在下一欄中的 Sample Name 輸入被選擇樣品組的名稱，并在 Sample Type 中選擇樣品組的類型阿逃，最后點(diǎn)擊 Make Replicates 設(shè)置復(fù)孔赃蛛。標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置時(shí)，需填寫拷貝數(shù)破托，只需填寫好稀釋倍數(shù)歧蒋，初始濃度即可。 編輯好樣品后谜洽，即可進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。如有需要锌俱，也可進(jìn)行子集編輯敌呈。

6造寝、結(jié)果分析

樣品編輯好后，可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析析显。

點(diǎn)擊左邊欄下方的 sum 按鈕签赃，相應(yīng)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的所有信息分尸，包括：設(shè)計(jì)的反應(yīng)程序歹嘹，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析等。

點(diǎn)擊 analysis材蛛，可以根據(jù)樣品已有的數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)致準(zhǔn)確地分析怎抛。

點(diǎn)擊 Abs Quant second derivative max，彈出 create new analysis 窗口马绝，在 Subset 選項(xiàng)中選擇分析樣品的分布區(qū)域，點(diǎn)擊確定河绽，即可出現(xiàn)分析圖：相應(yīng)樣品的擴(kuò)增曲線唉窃。

Standard Curve 是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線左側(cè)標(biāo)有擴(kuò)增效率苟跪、斜率蔓涧、截距、線性關(guān)系元暴、以及錯(cuò)誤率。一般“Error”值越小鉴未，說明實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率越高鸠姨。

擴(kuò)增效率如果越接近“2”，說明這次的擴(kuò)增反應(yīng)越好连茧。

在數(shù)據(jù)表格，可顯示單個(gè)樣本的 Cp 值啸驯，以及相應(yīng)的樣本濃度值罚斗。

按復(fù)孔進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，顯示 Cp 平均值惰聂，方差，濃度的平均值以及方差杆故。