編者按：隨著10X genomics 于2019年11月發(fā)布Visium Spatial Gene Expression Solution，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Spatial Transcriptome厌秒，ST）研究如火如荼纷捞。
2020年8月利用空間轉(zhuǎn)錄組研究AD的Cell文章見刊，國內(nèi)外團(tuán)隊(duì)如斯坦福大學(xué)Robert Roth等武氓、浙江大學(xué)Jie Liao和Xiaohui Fan等對空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)綜述文章更是點(diǎn)燃這一領(lǐng)域梯皿。

細(xì)胞學(xué)研究時(shí)代
一個(gè)多世紀(jì)前，現(xiàn)代病理學(xué)之父魯?shù)婪颉ぞS喬（Rudolph Virchow）開創(chuàng)了細(xì)胞時(shí)代县恕，他指出所有疾病都起源于細(xì)胞东羹。矛盾的是，盡管人們一致認(rèn)為細(xì)胞是多細(xì)胞生物的基本單元忠烛，但現(xiàn)代細(xì)胞和分子生物學(xué)知識主要來源于細(xì)胞群體的批量分析百姓，而目前對器官和組織等進(jìn)行基因表達(dá)分析的主流技術(shù)依然是批量RNA測序（bulk RNA-seq）。雖然bulk RNA-seq能夠全面快速地獲得特定細(xì)胞或組織在某一狀態(tài)下幾乎所有mRNA的序列和表達(dá)信息况木，但其分辨率低垒拢，結(jié)果是很多細(xì)胞混合后的“平均值”，差異表達(dá)基因存在一定假陽性和假陰性火惊，組織異質(zhì)性被掩蓋（圖1）求类。

圖1 組織研究的三種技術(shù)路線

圖1 組織研究的三種技術(shù)路線
二 單細(xì)胞研究
因此，對組織和器官進(jìn)行單細(xì)胞分辨率研究越來越重要屹耐。早期單細(xì)胞研究主要使用定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）尸疆、熒光活化細(xì)胞分選法（FACS）和免疫熒光原位雜交（FISH），只能研究數(shù)量有限的基因或蛋白質(zhì)惶岭。隨著技術(shù)進(jìn)步寿弱，鑒定到基因或蛋白的通量日益增加。現(xiàn)在按灶，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)（CyTOF）使用金屬結(jié)合抗體可同時(shí)檢測多達(dá)40種蛋白質(zhì)症革。這些技術(shù)有助于描述細(xì)胞類型和亞型，但它們依賴于一組預(yù)先設(shè)計(jì)的基因或蛋白鸯旁，這可能會使研究產(chǎn)生偏倚噪矛，并且需要先驗(yàn)知識，比如提前確認(rèn)細(xì)胞表面的關(guān)鍵分子標(biāo)志物铺罢，而這些分子標(biāo)志物往往是未知的艇挨。 相比之下，單細(xì)胞基因組學(xué)提供了在單細(xì)胞水平上以一種無偏倚韭赘、高通量方式來分析組織的方法缩滨。2009年，湯富酬教授等人提出了第一個(gè)基于改進(jìn)的cDNA擴(kuò)增的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法（scRNA-seq），在含有裂解緩沖液的Eppendorf管中分離單個(gè)卵母細(xì)胞（Tang’s Method）脉漏。兩年后蛋勺，Navin等人從乳腺癌樣本中產(chǎn)生了第一個(gè)單細(xì)胞基因組。正是這些開創(chuàng)性研究打開了單細(xì)胞基因組學(xué)新領(lǐng)域大門鸠删。近10年來，各種單細(xì)胞研究方法層出不窮（見圖2和表1）贼陶，所有步驟都脫胎于bulk RNA-seq protocols刃泡。這些scRNA-seq方法都需要解離實(shí)體組織以獲得單細(xì)胞，并對其RNA進(jìn)行標(biāo)記和擴(kuò)增以進(jìn)行測序碉怔，差別主要在于單細(xì)胞分離技術(shù)烘贴。

圖2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展史

目前主流細(xì)胞分離技術(shù)如下：

1. Micropipetting micromanipulation（口吸管技術(shù)）；
2. Laser capture microdissection（激光捕獲顯微切割技術(shù)）撮胧；
3. Fluorescence activated Cell Sorting桨踪，F(xiàn)ACS（流式細(xì)胞儀技術(shù)）；
4. Microdroplets（微滴技術(shù)）芹啥；
5. Microfluidics（微流體技術(shù)）锻离；

單細(xì)胞技術(shù)主要應(yīng)用于以下方向：

1. 研究一個(gè)組織中細(xì)胞種類；
2. 識別罕見或未知細(xì)胞類型或狀態(tài)墓怀；
3. 闡明在分化過程或時(shí)間及狀態(tài)變化中基因表達(dá)的改變汽纠；
4. 找出在不同條件下（如生理和病理）在某一特定類型細(xì)胞中差異表達(dá)基因；
5. 探究細(xì)胞類型之間基因表達(dá)的變化傀履，同時(shí)納入空間虱朵、調(diào)控和（或）蛋白質(zhì)信息；

單細(xì)胞測序常見分析方法包括：

1. 探究異質(zhì)性 (Studying heterogeneity)钓账；

2. 譜系路徑分析 (Lineage tracing study)碴犬；

3. 隨機(jī)基因表達(dá)研究 (Stochastic gene expression study)；

   單細(xì)胞測序揭示了過去我們認(rèn)為透徹研究疾病中存在著未知細(xì)胞類型梆暮，例如發(fā)現(xiàn)肺離子細(xì)胞 (ionocyte cells)服协，這可能與囊性纖維化病理學(xué)機(jī)制有關(guān)。 單細(xì)胞方法比批量分析的核心優(yōu)勢在于啦粹，保留單細(xì)胞信息可以揭示罕見細(xì)胞特性和生物學(xué)意義上的細(xì)胞間異質(zhì)性蚯涮。然而，與循環(huán)血細(xì)胞不同的是卖陵，固體組織和器官必須通過機(jī)械或酶分解才能進(jìn)行單細(xì)胞分析遭顶。這個(gè)過程不可避免地會導(dǎo)致位置信息丟失，使得無法評估單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組在整個(gè)組織中空間組織方式泪蔫，同時(shí)也會在一定程度上改變細(xì)胞狀態(tài)及其基因表達(dá)狀態(tài)棒旗。 表1 單細(xì)胞測序技術(shù)（部分）

   
   
   表1 單細(xì)胞測序技術(shù)（部分）

三 空間轉(zhuǎn)錄組研究 空間異質(zhì)性是器官功能的一個(gè)重要特征。人體組織是高度復(fù)雜系統(tǒng)，由多達(dá)數(shù)萬億個(gè)細(xì)胞組成铣揉，這些細(xì)胞在種類饶深、時(shí)間和空間上各不相同，但它們相互協(xié)調(diào)逛拱，形成獨(dú)特微環(huán)境敌厘，以維持器官功能和處理信息，進(jìn)而決定細(xì)胞特性朽合。在哺乳動物器官中俱两，具有不同功能類型和發(fā)育（時(shí)間）和區(qū)域（空間）差異的無數(shù)細(xì)胞構(gòu)成了大多數(shù)轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性。雖然高通量單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）在推斷細(xì)胞類型和軌跡方面取得了相當(dāng)大成功曹步。目前一些策略已經(jīng)應(yīng)用于揭示細(xì)胞命運(yùn)決定（cell fate decisions）宪彩、細(xì)胞譜系（cell lineages）和發(fā)育軌跡（developmental trajectories），如偽時(shí)間分析（pseudotemporal analysis）讲婚、可標(biāo)記細(xì)胞來源的內(nèi)源性條形碼（endogenous barcoding）尿孔、以及在特定時(shí)間間隔內(nèi)連續(xù)取樣（continuous sampling）。然而筹麸，空間異質(zhì)性仍然是一個(gè)棘手問題活合，因?yàn)榧?xì)胞一旦在懸浮液中分離，就會丟失其位置信息物赶。 因此芜辕，幾十年來，在空間水平研究組織基因表達(dá)的技術(shù)層出不窮（圖3）块差。從早期使用熒光原位雜交（FISH）到目前單細(xì)胞分辨率下空間轉(zhuǎn)錄組侵续，以及最近的multiplexed error robust FISH（MERFISH）。

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圖3 空間轉(zhuǎn)錄組方法的細(xì)胞和基因的分辨率憨闰。這里把不同方法根據(jù)其類別用不同形狀状蜗、符號和大小顯示○亩縮寫：ExFISH, expansion FISH; FISH, ?uorescence in situ hybridization; FISSEQ, ?uorescence in situ sequencing; GEO-seq, geographical position sequencing; HDST, high-de?nition spatial transcriptomics; ISS, in situ sequencing; LCM, laser capture microdissection; MERFISH, multiplexed error-robust FISH; MAPseq, multiplexed analysis of projections by sequencing; osmFISH, ouroboros single-molecule FISH; PLISH, proximity ligation in situ hybridization; secFISH, sequential FISH; smHCR, single-molecule hybridization chain reaction; SRM, super resolution microscopy; STARmap, spatially-resolved transcript amplicon readout mapping; TIVA, transcriptome in vivo analysis; TSCS, topographic single-cell sequencing. 現(xiàn)有空間轉(zhuǎn)錄組方法可分為四類：

1. 基于計(jì)算策略和組學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的空間重建方法轧坎；

2. 基于激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection，LCM）與NGS相結(jié)合的直接測量法泽示；

3. 基于成像的原位轉(zhuǎn)錄組學(xué)缸血；

4. 基于寡核苷酸空間條形碼和NGS的方法；

   每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)械筛，比如基因概況（即檢測到基因種類數(shù)）和細(xì)胞數(shù)（即一次分析細(xì)胞個(gè)數(shù)）的差異捎泻，圖3和表2顯示了用于解碼空間異構(gòu)性的不同方法的通量。 表2 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)特點(diǎn)介紹（部分）

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1埋哟，計(jì)算策略的空間轉(zhuǎn)錄組
由于基于流式細(xì)胞的scRNA-seq丟失了細(xì)胞坐標(biāo)信息笆豁，而RNA-staining方法只檢測了總轉(zhuǎn)錄物的一部分，因此，計(jì)算生物學(xué)通過整合多尺度數(shù)據(jù)來重建組織的空間轉(zhuǎn)錄組闯狱。例如煞赢，Satija等提出了Seurat（圖4A），這是一個(gè)R包哄孤，通過結(jié)合scRNA-seq數(shù)據(jù)和marker基因的in situhybridizations來推斷細(xì)胞定位照筑。比如，通過SMART-seq獲得斑馬魚胚胎發(fā)育過程中851個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞基因表達(dá)瘦陈，后續(xù)分析將細(xì)胞分為不同類型凝危，并為每種細(xì)胞類型生成landmark基因。然后双饥，landmark基因的FISH數(shù)據(jù)提供了這些表達(dá)模式的空間分布，產(chǎn)生了landmark基因在整個(gè)組織中的表達(dá)密度弟断。最后根據(jù)marker基因的表達(dá)譜和標(biāo)記基因的表達(dá)密度可以對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行定位咏花。最近，這個(gè)小組發(fā)布了Seurat第三個(gè)版本阀趴，用于跨數(shù)據(jù)集的單細(xì)胞信息綜合集成昏翰。類似地，Achim等提出了一種方法刘急，通過比較scRNA-seq數(shù)據(jù)和從單個(gè)基因表達(dá)圖譜中獲得的空間基因表達(dá)（positional gene expression）來定位單個(gè)細(xì)胞棚菊。 此外，Durruthy-Durruthy等建立了一個(gè)使用單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)的空心球形態(tài)學(xué)來實(shí)現(xiàn)組織3D重建的標(biāo)準(zhǔn)方法叔汁。這種計(jì)算方法在單個(gè)細(xì)胞的大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中统求，充分利用其內(nèi)在基因表達(dá)模式或共表達(dá)趨勢，從而獲得細(xì)胞間的context据块；然而码邻，這些演繹方法在某些情況下是受限的，只呈現(xiàn)特定組織的空間趨勢或總體布局另假。因此像屋，需要更深入的分析，才能實(shí)現(xiàn)對組織中實(shí)際的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本的更精確定位边篮。2己莺，基于LCM的方法 獲取攜帶精確位置信息轉(zhuǎn)錄本的另一種策略是使用LCM從組織切片中分離單個(gè)細(xì)胞或整個(gè)目標(biāo)區(qū)域，LCM是一種顯微鏡引導(dǎo)的強(qiáng)大切割系統(tǒng)戈轿，將紫外光作為無接觸和無污染的刀片凌受。目標(biāo)細(xì)胞被切割并收集在不同容器中以盡量減少空間信息丟失。隨后思杯，細(xì)胞可以通過直接RNA-seq或預(yù)先設(shè)計(jì)的空間條形碼來標(biāo)記等多步驟過程來獲得其表達(dá)譜胁艰。 LCM-seq（圖4B）旨在為基于LCM的直接scRNA-seq提供標(biāo)準(zhǔn)方法。例如，使用LCM與smart-seq2結(jié)合腾么，對小鼠運(yùn)動神經(jīng)元和人類死后組織進(jìn)行精確空間轉(zhuǎn)錄組分析奈梳。研究表明，scRNA-seq是可行的解虱，基于LCM-seq的成功率為62%攘须，在不同情況下表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)谋憷浴４送猓?016年中科院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心景乃禾****&中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院彭廣敦開發(fā)了geographical position sequencing (GEO-seq）殴泰，該方法實(shí)現(xiàn)了對少量細(xì)胞的整個(gè)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析的同時(shí)于宙，利用某些特定關(guān)鍵基因（zip-code基因）將細(xì)胞映射回其原始位置，因此保留了細(xì)胞原始空間位置信息（圖4B） 此外悍汛，Casasent等開發(fā)了一種基于LCM方法捞魁，稱為topographic single cell sequencing（TSCS），以比較原位導(dǎo)管癌（DCIS）區(qū)域和浸潤性導(dǎo)管癌（IDC）區(qū)域細(xì)胞之間基因組變異离咐。將組織切片放在載玻片上谱俭，用蘇木精和伊紅（H&E）染色，以便在顯微鏡下識別單個(gè)細(xì)胞核（圖4B）宵蛀。然后使用LCM系統(tǒng)從組織切片中捕捉單個(gè)細(xì)胞昆著，同時(shí)記錄每組坐標(biāo)。接下來术陶，將細(xì)胞分離到一個(gè)預(yù)先編碼的緩沖液中凑懂，在緩沖液中進(jìn)行裂解和全基因組擴(kuò)增（WGA）。最后梧宫，對所有cDNA的NGS建庫測序接谨。通過LCM總共分離到1293個(gè)單細(xì)胞，隨后進(jìn)行單核測序（SNS）塘匣。 基于LCM的轉(zhuǎn)錄組學(xué)或基因組學(xué)成功地獲得了單個(gè)細(xì)胞的空間轉(zhuǎn)錄本疤坝，盡管其通量很低，然而馆铁，在新技術(shù)（即可以標(biāo)記出成千上萬個(gè)單一的特定位置細(xì)胞的空間條形碼技術(shù)）出現(xiàn)之前跑揉，它可以粗略地將少數(shù)細(xì)胞的數(shù)據(jù)整合到構(gòu)成器官的巨大背景中，就像向海洋中注入水滴一樣有用埠巨。

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圖4 四種空間轉(zhuǎn)錄組的技術(shù)示意圖3历谍，基于成像的In Situ轉(zhuǎn)錄組學(xué)** 基于成像的原位轉(zhuǎn)錄組學(xué)使得細(xì)胞通量不再是個(gè)問題。早期能夠檢測單個(gè)轉(zhuǎn)錄本方法被稱為單分子FISH（smFISH）辣垒，它使用FISH以亞細(xì)胞分辨率同時(shí)測量一到多個(gè)（通常為3或4個(gè)）mRNA望侈。隨后，人們致力于用多通路smFISH以增加每個(gè)細(xì)胞位點(diǎn)可檢測的mRNA種類勋桶。Expansion FISH（ExFISH）可以從數(shù)十個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中研究7個(gè)靶基因脱衙，而proximity ligation in situhybridization（PLISH）可檢測固定組織中8個(gè)基因侥猬。隨后的osmFISH能夠同時(shí)從組織切片中鑒定數(shù)千個(gè)細(xì)胞的33個(gè)基因。Sequential FISH（seqFISH）是另一種通過多輪雜交來編碼單個(gè)細(xì)胞內(nèi)不同轉(zhuǎn)錄本方法捐韩。隨著這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)步退唠，檢測能力已從固定細(xì)胞（?xed cells）中12個(gè)基因增加到組織切片中10000多個(gè)基因。 類似地荤胁，另一種MERFISH方法可以顯著增加單個(gè)細(xì)胞中可測量數(shù)量瞧预，高達(dá)1000個(gè)mRNA（圖4C）。MERFISH不是設(shè)計(jì)一個(gè)獨(dú)特探針靶向特定mRNA仅政，而是整合一個(gè)框架垢油，將每個(gè)RNA原位轉(zhuǎn)化為一個(gè)獨(dú)特N位字符（N-bit word）。通過靶向特定RNA集合的子集圆丹，如果觀察點(diǎn)上存在熒光點(diǎn)滩愁，則輸出結(jié)果為1，否則為0辫封。經(jīng)過N輪雜交后硝枉，理論上可以探測到2^N-1 種RNA。然而秸讹，隨著N輪的增加檀咙，檢測錯(cuò)誤率逐漸增加雅倒，導(dǎo)致可檢測mRNA種類縮小到1000個(gè)璃诀。對N位字符進(jìn)行解碼后，可以將相應(yīng)mRNA映射到它們的空間位置蔑匣。值得注意的是劣欢，近年來MERFISH在分析超過100萬個(gè)細(xì)胞和靶向10000個(gè)mRNA這兩個(gè)方向上得到了極大改進(jìn)。 18年斯坦福大學(xué)Karl Deisseroth教授新開發(fā)的STARmap（spatially-resolved transcript amplicon readout mapping）裁良，可直接靶向1000多個(gè)基因凿将。與其他基于成像的方法相似，水凝膠-組織化學(xué)使得組織內(nèi)每個(gè)細(xì)胞成為RNA成像的可觀察的理想容器（圖4C）价脾。一個(gè)巧妙的掛鎖系統(tǒng)（padlock system）設(shè)計(jì)牧抵，由一對引物和一對掛鎖探針組成，通過分子內(nèi)交聯(lián)（speci?c ampli?cation of nucleic acids via intramolecular ligation侨把，SNAIL）對核酸進(jìn)行特異性擴(kuò)增犀变。值得注意的是，只有當(dāng)兩個(gè)引物都與同一個(gè)mRNA對齊時(shí)秋柄，掛鎖探針才能進(jìn)行滾圈擴(kuò)增并產(chǎn)生一個(gè)稱為擴(kuò)增子的DNA納米球获枝。每個(gè)掛鎖探針都有一個(gè)5位堿基條形碼（庫容量為1024），作為基因特異性標(biāo)識符骇笔。為降低單堿基測序的錯(cuò)誤率省店，與傳統(tǒng)僅編碼單個(gè)堿基方法相比嚣崭，本研究定制了一種稱為動態(tài)退火和交聯(lián)以減少錯(cuò)誤的測序方法（sequencing with error-reduction by dynamic annealing and ligation，SEDAL）懦傍，將兩個(gè)連續(xù)堿基編碼為一種顏色超埋。經(jīng)過六輪測序后，每個(gè)條形碼都被解碼并注釋到特定mRNA上咧叭。使用這種方法澳化，可以評估細(xì)胞類型的空間分布，并獲得完整組織的三維視圖源梭。相比之下娱俺，有兩種與STARmap原理相似的早期方法，稱為原位測序（in situsequencing废麻，ISS）和熒光原位測序（fluorescence in situ sequencing荠卷，F(xiàn)ISSEQ）。ISS是一種比STARmap靶向mRNA數(shù)目更少和探測準(zhǔn)確性更低的靶向檢測方法烛愧。FISSEQ通過讀取每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的27個(gè)堿基油宜，能夠在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中非特異性檢測到超過8000多種RNA。然而怜姿，由于難以在原位生成長片段reads慎冤，因此無法應(yīng)用于組織切片。最近沧卢，F(xiàn)ürth等提出一種新方法蚁堤，即原位轉(zhuǎn)錄組可及性測序（in situ transcriptome accessibility sequencing，INSTA-seq）但狭，允許對目前基于雜交的方法或受限于短片段的原位測序無法區(qū)分的小調(diào)控變體（small regulatory variants）進(jìn)行無偏研究披诗。 基于成像的原位轉(zhuǎn)錄組學(xué)在很大程度上增加了可檢測區(qū)域，但也帶來了一些挑戰(zhàn)性問題立磁。例如呈队，一些smFISH方法可以在整個(gè)組織中實(shí)現(xiàn)定量mRNA成像。然而唱歧，單個(gè)細(xì)胞很難從復(fù)雜背景（包括信號干擾宪摧、轉(zhuǎn)錄物積累和細(xì)胞擁擠）中提取出來。此外颅崩，與RNA-seq相比几于，這些靶向方法有較高錯(cuò)誤率并需要預(yù)選基因。當(dāng)使用一組探針作為誘餌來獲取特定RNA全部信息時(shí)挨摸，很容易出現(xiàn)錯(cuò)誤孩革。與RNA-seq另一個(gè)主要區(qū)別是，靶向方法不能檢測新序列或小序列變體得运。4膝蜈，空間條形碼結(jié)合NGS 考慮到使用探針來原位靶向檢測RNA方法的缺點(diǎn)锅移，人們對直接原位測序或?qū)M織切片進(jìn)行空間標(biāo)記的興趣越來越大。 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Spatial transcriptomics饱搏，ST）（圖4D）通過一種具有大量分散分布100μm大小微孔的特制載玻片來捕獲mRNAs非剃。每個(gè)孔都覆蓋一或多個(gè)寡核苷酸鏈，該寡核苷酸鏈包含一段每個(gè)微孔特異性的空間條形碼推沸，和一個(gè)與poly A互補(bǔ)以捕獲mRNA的poly T尾巴备绽。在一個(gè)6 mm×6 mm正方形捕獲區(qū)域中，總共產(chǎn)生了1007個(gè)條形碼微孔鬓催。經(jīng)過酶透化后肺素，組織切片中mRNAs從細(xì)胞中釋放到玻片上，被微孔內(nèi)寡核苷酸捕獲宇驾。在載玻片上進(jìn)行cDNA合成倍靡。隨后利用NGS進(jìn)行RNA-seq，基于空間條形碼獲取其原始空間位置信息课舍。最近塌西，高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（high-definition spatial transcriptomics，HDST）已經(jīng)被開發(fā)出來筝尾，它使用分割池方法（split-pool approach）產(chǎn)生高分辨率（2μm）捡需、高密度（數(shù)百萬）微珠陣列。與ST相比筹淫，HDST明顯提高了空間分辨率站辉，但HDST平均每個(gè)微孔（well）有7個(gè)唯一分子標(biāo)識符（unique molecular identifiers，UMI）贸街，嚴(yán)重限制了其測量高豐度基因能力庵寞。 為了給高通量實(shí)驗(yàn)提供足夠空間信息狸相，Slide-seq（圖4D）應(yīng)運(yùn)而生薛匪。在Slide-seq中，首先在涂有橡膠的玻璃蓋玻片表面填充一層10 μm的特異性條形碼微珠（beads）脓鹃。與其他高通量scRNA-seq方法中使用的微珠類似逸尖，每個(gè)微珠上條形碼是隨機(jī)分布的。因此瘸右，先對每個(gè)微珠上寡核苷酸條形碼進(jìn)行識別娇跟，再進(jìn)行混合測序。為解決這一問題太颤，Slide-seq后續(xù)利用SOLiD化學(xué)技術(shù)（sequencing by oligonucleotide ligation and detection）來讀取每個(gè)柱子上不同條形碼苞俘。先識別每個(gè)10 μm捕獲點(diǎn)（spot）中特異性空間標(biāo)識符，再行RNA-seq龄章，因此寡核苷酸捕獲的mRNAs可以映射回它們的原始空間坐標(biāo)吃谣。Slide-seq以單細(xì)胞分辨率對150萬個(gè)捕獲點(diǎn)進(jìn)行測序乞封。不幸的是，與Drop-seq相比岗憋，Slide-seq每個(gè)微珠的UMI更少肃晚。 一旦轉(zhuǎn)錄水平和空間位置有一一對應(yīng)關(guān)系，空間條形碼結(jié)合NGS技術(shù)構(gòu)成了一個(gè)直觀概念來定位大量單點(diǎn)仔戈。因此有兩種方法关串，一是合成足夠多特異性條形碼并將其分配給特定捕獲點(diǎn)，二是增加一個(gè)測序步驟以定位每個(gè)編碼的微珠监徘。然而晋修，這兩種方法都很昂貴，而且都不能在單個(gè)細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)錄本凰盔。 基于條形碼和NGS的空間轉(zhuǎn)錄組飞蚓，近幾年有了新突破。2016年廊蜒，瑞典皇家理工學(xué)院Joakim Lundeberg（瑞典Spatial Transcriptomics公司聯(lián)合創(chuàng)始人）在Science上發(fā)文趴拧，利用基因芯片技術(shù)將位置信息保留在芯片上，再利用二代測序技術(shù)對組織中RNA進(jìn)行測序山叮，從而生成組織切片上完整的基因表達(dá)圖像著榴。2018年底，10X Genomics宣布收購Spatial Transcriptomics屁倔，并于2019年11月發(fā)布Visium空間基因表達(dá)解決方案（Visium Spatial Gene Expression Solution）脑又。

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1. 樣本制備（Sample Preparation，SP）锐借。新鮮組織樣本進(jìn)行異戊烷固定问麸、液氮速凍和OCT包埋；隨后用冷凍切片機(jī)進(jìn)行切片钞翔，準(zhǔn)備5~10張切片提取RNA并進(jìn)行質(zhì)量評估（要求RIN值>7.0）严卖；

2. 組織透化（Tissue Optimization，TO）布轿。將切片放置在TO玻片上哮笆，用不同時(shí)間梯度的透化劑處理組織，使細(xì)胞中mRNA落入玻片并與玻片上寡核苷酸標(biāo)簽結(jié)合后汰扭，進(jìn)行cDNA合成稠肘，熒光成像，以確定最佳透化時(shí)間萝毛。隨后取切片在文庫制備（LP）玻片上進(jìn)行正式透化實(shí)驗(yàn)项阴。

3. cDNA合成和文庫制備（cDNA generation & Library Preparation）。mRNA的poly A尾巴與探針標(biāo)簽poly T互補(bǔ)笆包，并合成cDNA环揽，構(gòu)建10x Visium文庫 拷沸。

4. 測序和分析（Sequencing & Data Visualization）。進(jìn)行PE150測序薯演，并使用相關(guān)工具比如Space Ranger和Loupe Browser 等軟件進(jìn)行可視化分析撞芍。

   10X Visium空間基因表達(dá)解決方案技術(shù)核心在于2種載玻片，1種是組織優(yōu)化玻片跨扮，包含8個(gè)捕獲區(qū)域序无，其中6個(gè)區(qū)域分別設(shè)置6個(gè)不同透化時(shí)間，另外兩個(gè)區(qū)域1個(gè)為不加透化劑的陰性對照衡创，另1個(gè)為陽性對照帝嗡，不放組織切片，而是直接加入RNA璃氢。其實(shí)驗(yàn)流程為：固定→染色→明場拍照→組織透化→熒光cDNA合成→組織移除→熒光掃描哟玷，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷最優(yōu)透化時(shí)間。1****種是文庫制備玻片（圖****6****）一也，上有4個(gè)捕獲區(qū)域（6.5x6.5mm巢寡，圖6中4個(gè)小方框），每個(gè)捕獲區(qū)域含4992個(gè)用條形碼編碼的捕獲點(diǎn)（barcoded spots椰苟，圖6中彩色圓點(diǎn)）抑月，直徑為55μm，兩個(gè)spot中心的間距為100μm舆蝴，每個(gè)spot都有數(shù)百萬條寡核苷酸標(biāo)簽谦絮，每個(gè)spot上所有寡核苷酸標(biāo)簽的Spatial Barcode序列都是相同的，而不同spot之間Spatial Barcode是不同的洁仗，根據(jù)mRNA對應(yīng)的Spatial Barcode（spot的位置信息）就可以獲取其空間位置信息层皱。

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圖6 10X Visium空間轉(zhuǎn)錄組文庫制備玻片 10X Visium空間轉(zhuǎn)錄組，無需解離單細(xì)胞來制備單細(xì)胞懸液赠潦，與其它方法相比叫胖，實(shí)驗(yàn)流程非常簡單，只需提供H&E染色切片祭椰，就可得到切片相應(yīng)位置基因表達(dá)信息臭家，將傳統(tǒng)組織學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢與RNA測序的高通量特點(diǎn)相結(jié)合疲陕，在組織中呈現(xiàn)基因表達(dá)空間分辨率水平的可視化信息方淤。除切片機(jī)和顯微鏡外無需額外購買昂貴硬件設(shè)備，可以實(shí)現(xiàn)相對低成本蹄殃、一次獲取5000~10000個(gè)細(xì)胞和幾乎全部轉(zhuǎn)錄本携茂，通量相對較高，主要缺陷是沒有達(dá)到單細(xì)胞分辨率（每個(gè)spot中有1-10個(gè)細(xì)胞）诅岩。四 空間轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用 雖然目前空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)尚不完善讳苦，但已廣泛應(yīng)用于臨床和生物學(xué)研究中带膜。1，發(fā)現(xiàn)疾病的空間異質(zhì)性 基因表達(dá)在許多生物過程中呈現(xiàn)空間模式鸳谜。然而這些模式很少是通過傳統(tǒng)bulk RNA-seq或經(jīng)典scRNA-seq發(fā)現(xiàn)的膝藕。在疾病發(fā)生發(fā)展中，空間異質(zhì)性至關(guān)重要咐扭。同時(shí)研究病變組織中細(xì)胞類型及其定位迫切需要空間轉(zhuǎn)錄組芭挽。例如，在小鼠阿爾茨海默不确尽（AD）模型中使用scRNA-seq袜爪，發(fā)現(xiàn)一種新的小膠質(zhì)細(xì)胞類型與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。為了定位這些小膠質(zhì)細(xì)胞薛闪，作者鑒定了標(biāo)記物并使用smFISH來“照亮”它們辛馆。在該研究中，這些被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞特異性定位在AD斑塊附近豁延，這表明這種細(xì)胞類型可能與AD起源密切相關(guān)昙篙，并為開發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞激活藥物作為靶向治療策略提供了新思路。此外诱咏，在與大量表型變化相關(guān)疾病中瓢对，如癌癥，不同細(xì)胞的基因表達(dá)可能會有明顯差異以適應(yīng)各自微環(huán)境胰苏。例如硕蛹，Little等在病理標(biāo)本中使用詳細(xì)的多色FISH技術(shù)研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，在幾乎沒有血管的區(qū)域觀察到癌細(xì)胞硕并。而且這些細(xì)胞表現(xiàn)出表皮生長因子受體的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增法焰，而血小板衍生生長因子受體基因擴(kuò)增的癌細(xì)胞則在內(nèi)皮細(xì)胞附近富集。相比之下倔毙，基于LCM的方法適合于小樣本（如臨床樣本）和全轉(zhuǎn)錄組或基因組分析埃仪，因?yàn)槠浼?xì)胞吞吐量低，但它能實(shí)現(xiàn)全基因覆蓋和無偏見的細(xì)胞分離陕赃。2卵蛉，構(gòu)建空間轉(zhuǎn)錄組圖譜 利用空間分辨的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)，在分子水平研究生命體結(jié)構(gòu)的重要步驟是構(gòu)建圖譜么库。因此美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）將在未來7年內(nèi)投入大量精力傻丝，開發(fā)一套史無前例的人類生物分子圖譜。美國國立衛(wèi)生研究院共同基金人類生物分子圖譜計(jì)劃（Human Biomolecular Atlas Program诉儒，HuBMAP）旨在通過支持技術(shù)開發(fā)葡缰、數(shù)據(jù)采集和精細(xì)空間定位，建立一個(gè)單細(xì)胞分辨率開放式圖譜框架。在小鼠中泛释，除了基于MERFISH從小鼠大腦中下丘腦視前區(qū)110萬個(gè)細(xì)胞中繪制了轉(zhuǎn)錄組圖景外滤愕，Deisseroth等擴(kuò)展了他們的STARmap方法，在6層完整的小鼠初級視覺皮層的30000多個(gè)細(xì)胞中研究了23個(gè)細(xì)胞類型marker的表達(dá)譜怜校，以進(jìn)一步研究完整大腦的三維復(fù)雜性间影。Zeisel等結(jié)合scRNA-seq和FISH揭示了小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的分子結(jié)構(gòu)。他們繪制了大腦各個(gè)區(qū)域的細(xì)胞圖譜茄茁，并提供了一個(gè)按區(qū)域劃分的基因表達(dá)圖景和一個(gè)用于下一步研究的參考圖譜宇智。Asp等利用ST來研究人類心臟發(fā)育過程的時(shí)空基因表達(dá)譜。因此建立了一個(gè)跨越時(shí)間和空間的人類心臟發(fā)育圖譜胰丁。只有通過這些技術(shù)整合随橘，提高細(xì)胞和基因的檢測通量，同時(shí)保留細(xì)胞空間環(huán)境信息锦庸，才有可能建立一個(gè)完整生命體結(jié)構(gòu)的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜机蔗。 3，描繪胚胎發(fā)育和空間藍(lán)圖 胚胎發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜過程甘萧，其分子水平動態(tài)變化非常迅速萝嘁。解析這種時(shí)間和空間維度的微變化一直是個(gè)挑戰(zhàn)。利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)構(gòu)建胚胎發(fā)育的空間表達(dá)藍(lán)圖扬卷。在黑腹果蠅（D.melanogaster）與擬果蠅（D.Simulansbias）雜交胚胎發(fā)育過程中牙言，即使與幾乎同一物種相比其基因調(diào)控也表現(xiàn)出空間差異」值茫空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)用于發(fā)現(xiàn)受空間調(diào)控的不同基因咱枉，最后分別鑒定了84個(gè)和39個(gè)具有黑腹果蠅和擬果蠅偏好的特異性表達(dá)的等位基因。此外徒恋，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)在的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以與空間環(huán)境相互作用蚕断，從而確定細(xì)胞特性。例如入挣，Zhu等開發(fā)了一種基于全局基因表達(dá)方法亿乳，能夠區(qū)分小鼠視皮層區(qū)域的細(xì)胞類型和空間域相關(guān)異質(zhì)性。根據(jù)該方法径筏，在谷氨酸能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞小室中發(fā)現(xiàn)了明顯的空間相關(guān)而與細(xì)胞類型無關(guān)的信號葛假。Shinozaki等利用LCM以及手動切割結(jié)合RNA-seq，確定了不同區(qū)域和不同成熟度番茄基因表達(dá)模式的空間差異滋恬。peng等通過整合時(shí)空信息聊训，研究了小鼠早期胚胎中譜系分配（lineage allocation）和組織結(jié)構(gòu)化（tissue organization）的分子架構(gòu)，全面描繪了小鼠胚胎發(fā)育早期關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)夷恍。五 未來展望 雖然空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)在發(fā)現(xiàn)疾病因子魔眨、構(gòu)建空間圖譜和繪制空間藍(lán)圖方面得到廣泛應(yīng)用和推廣媳维，但其潛力遠(yuǎn)不止于此酿雪。例如在細(xì)胞間通訊研究中遏暴，不同細(xì)胞類型的環(huán)境相關(guān)互作是基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和已知的配體-受體復(fù)合物推斷而來的。然而細(xì)胞之間正在進(jìn)行的相互作用很難被瞬時(shí)捕捉指黎。無論是在組織還是在培養(yǎng)環(huán)境中朋凉，緊密空間中細(xì)胞更容易相互作用，這正是空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域醋安。將空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)引入細(xì)胞間通訊研究中非常值得期待杂彭。一些優(yōu)雅的實(shí)驗(yàn)顯示了缺血神經(jīng)元的體細(xì)胞線粒體和軸突線粒體在單細(xì)胞尺度上的通訊。此外吓揪，scRNA-seq技術(shù)在許多方面促進(jìn)了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)展亲怠，例如提供細(xì)胞分型標(biāo)記基因，這反過來又幫助scRNA-seq通過基因空間分布來區(qū)分亞群柠辞。此外团秽，由于基于成像的方法，如seqFISH+叭首、MERFISH和STARmap可以提供觀察單個(gè)細(xì)胞內(nèi)分子行為的亞細(xì)胞視圖习勤，因此分析基因間相互作用組、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和多模式組學(xué)成為可能焙格。研究表明图毕，DNA變異與mRNA表達(dá)有關(guān)，因此檢測分子的同時(shí)獲取其原始坐標(biāo)可加深我們對轉(zhuǎn)錄因子如何激活基因表達(dá)眷唉、基因間如何相互溝通以及細(xì)胞如何運(yùn)作的理解予颤。突破這些瓶頸（懸而未決的問題）已成為未來前進(jìn)方向。下期預(yù)告：小編解析2020年8月20日發(fā)表于Cell的空間轉(zhuǎn)錄組研究阿爾茲海默癥（AD）文章冬阳。添加小編（小愛同學(xué)）微信荣瑟，獲取最新空間轉(zhuǎn)錄組資料。

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參考文獻(xiàn)

1. Crosetto N, Bienko M, Van Oudenaarden A. Spatially resolved transcriptomics and beyond[J]. Nature Reviews Genetics, 2015, 16(1): 57-66.
2. Peng G, Suo S, Chen J, et al. Spatial transcriptome for the molecular annotation of lineage fates and cell identity in mid-gastrula mouse embryo[J]. Developmental cell, 2016, 36(6): 681-697.
3. Stahl P L, Salmén F, Vickovic S, et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics[J]. Science, 2016, 353(6294): 78-82.
4. Chen J, Suo S, Tam P P L, et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq[J]. Nature protocols, 2017, 12(3): 566-580.
5. Chen X, Teichmann S A, Meyer K B. From tissues to cell types and back: single-cell gene expression analysis of tissue architecture[J]. Annual Review of Biomedical Data Science, 2018.
6. Thrane K, Eriksson H, Maaskola J, et al. Spatially resolved transcriptomics enables dissection of genetic heterogeneity in stage III cutaneous malignant melanoma[J]. Cancer research, 2018, 78(20): 5970-5979.
7. Peng G, Suo S, Cui G, et al. Molecular architecture of lineage allocation and tissue organization in early mouse embryo[J]. Nature, 2019, 572(7770): 528-532.
8. Stark R, Grzelak M, Hadfield J. RNA sequencing: the teenage years[J]. Nature Reviews Genetics, 2019, 20(11): 631-656.
9. Zhou Y, Jia E, Pan M, et al. Encoding Method of Single-cell Spatial Transcriptomics Sequencing[J]. International Journal of Biological Sciences, 2020, 16(14): 2663.
10. Moris N, Anlas K, van den Brink S C, et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development[J]. Nature, 2020: 1-6.
11. Moor A E, Itzkovitz S. Spatial transcriptomics: paving the way for tissue-level systems biology[J]. Current opinion in biotechnology, 2017, 46: 126-133.
12. Ortiz C, Navarro J F, Jurek A, et al. Molecular atlas of the adult mouse brain[J]. Science Advances, 2020, 6(26): eabb3446.
13. Roth R, Kim S, Kim J, et al. Single-cell and spatial transcriptomics approaches of cardiovascular development and disease[J]. BMB reports, 2020.
14. Bingham G C, Lee F, Naba A, et al. Spatial-omics: Novel Approaches to Probe Cell Heterogeneity and Extracellular Matrix Biology[J]. Matrix Biology, 2020.
15. Lein E, Borm L E, Linnarsson S. The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing[J]. Science, 2017, 358(6359): 64-69.
16. Saviano A, Henderson N C, Baumert T F. Single-cell genomics and spatial transcriptomics: discovery of novel cell states and cellular interactions in liver physiology and disease biology[J]. Journal of Hepatology, 2020.
17. Chen W T, Lu A, Craessaerts K, et al. Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer’s Disease[J]. Cell, 2020.
18. Peng G, Cui G, Ke J, et al. Using Single-Cell and Spatial Transcriptomes to Understand Stem Cell Lineage Specification During Early Embryo Development[J]. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 2020, 21.
19. Liao J, Lu X, Shao X, et al. Uncovering an Organ’s Molecular Architecture at Single-Cell Resolution by Spatially Resolved Transcriptomics[J]. Trends in Biotechnology, 2020.