Prosurvival longnoncoding RNA PINCR regulates a subset of p53 targets in human colorectal cancer cells by binding to Matrin 3
一肌访、調(diào)控通路
在細胞DNA損傷的情況下晤揣，P53促進LncRNA PINCR表達显熏，然后PINCT招募Matrin-3與P53結(jié)合形成復(fù)合體結(jié)合到P53靶標(biāo)基因的增強子區(qū)域惕稻，促進基因的表達使細胞抗死亡能力增強埂蕊。
二、實驗流程
作者首先通過藥理抑制P53與Matrin-3活性后的基因芯片篩選P53靶標(biāo)基因和LncRNA硅瞧，用Matrin-3處理細胞后進行q-pcr檢測幾種RNA的表達篩選出本文主角PINCR禁偎。用DOXO（阿霉素：DNA損傷處理）處理P53野生型和P53刪除細胞后檢測PINCR的表達說明DNA損傷后PINCR受P53誘導(dǎo)表達建丧；為了驗證P53對PINCR的作用排龄，作者分別進行熒光素酶實驗和ChIP實驗說明P53促進PINCR啟動子活性。在研究PINCR的功能是茶鹃，作者首先進行核質(zhì)分離后檢測PINCR涣雕，表明PINCR在細胞核中可能參與基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控，然后再進行RNA pull-down闭翩、ChIP挣郭、co-IP等分別說明PINCR與P53/Matrin-3結(jié)合、P53與Matrin-3結(jié)合疗韵、P53/Matrin-3與靶標(biāo)基因的啟動子和增強子結(jié)合兑障。
三、核心FIGURE
Figure1說明的是PINCR是在細胞DNA損傷后由P53直接調(diào)控的核內(nèi)LncRNA蕉汪。
A流译、q-pcr檢測經(jīng)Nutlin-3誘導(dǎo)后的結(jié)直腸癌癌三種細胞系的P53靶標(biāo)基因表達，表明PINCR表達升高者疤；
B福澡、q-pcr檢測經(jīng)DOXO（阿霉素：DNA損傷處理）處理后的P53野生型和突變型細胞的PINCR表達，表明DNA損傷后PINCR表達升高驹马，而P53突變后的PINCR表達明顯比野生型低革砸，說明PINCR表達與P53有關(guān)。
C糯累、ChIP-SEQ算利，分別用Nutlin、5-FU泳姐、RITA和CTL處理細胞后用P53抗體獲取與P53結(jié)合的DNA片段效拭，產(chǎn)物進行高通量測序，表明Nutlin-3可使P53結(jié)合到PINCR啟動子上胖秒。
D缎患、ChIP-qpcr，細胞經(jīng)DOXO（阿霉素：DNA損傷處理）處理后用P53抗體獲取與P53結(jié)合的DNA片段阎肝，然后進行Q-PCR檢測挤渔，表明細胞DNA損傷后P53結(jié)合到PINCR啟動子上升。
E-F盗痒、熒光素酶實驗，將PINCR啟動子序列連接到熒光素酶報告質(zhì)粒上，與P53表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞俯邓，然后檢測熒光素酶活性骡楼，表明P53促進PINCR啟動子活性。
H稽鞭、核質(zhì)分離后分別檢測細胞核和細胞質(zhì)的RNA含量鸟整，表明PINCR基本在細胞核中，說明PINCR可能參與的是核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控朦蕴。
Figure2說明的是在DNA損傷時PINCR減少使G1捕獲降低即增加細胞死亡篮条。
A、用CRISPR/Cas9在HCT116細胞中刪除基因組上的PINCR基因吩抓，然后用Q-PCR檢測DOXO處理后的細胞PINCR的表達涉茧，表明DOXO處理細胞后PINCR升高，而刪除基因后PINCR不能表達疹娶。
B-C伴栓、采用PI染色做流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，DOXO處理細胞后刪除基因組上的PINCR基因的細胞系細胞凋亡明顯比PINCR野生型的多雨饺。
D钳垮、在刪除基因組上的PINCR基因的細胞中轉(zhuǎn)染PINCR表達質(zhì)粒后檢測PINCR表達，表明PINCR在細胞中表達额港。
E饺窿、在刪除基因組上的PINCR基因的細胞中轉(zhuǎn)染PINCR表達質(zhì)粒后檢測細胞凋亡，表明PINCR表達使細胞凋亡減少移斩。
F肚医、FISH檢測核孔蛋白和細胞凋亡蛋白，表明DNA損傷后叹哭，基因組上刪除了PINCR的細胞細胞凋亡蛋白表達增加忍宋。
G、克隆形成觀察风罩，DOXO處理細胞后糠排，細胞的生長減少，基因組上刪除了PINCR的細胞明顯比野生型細胞生長少超升。
Figure3說明的是DNA損傷后入宦，PINCR調(diào)控P53靶標(biāo)基因的表達。
A室琢、DNA損傷處理后用P53處理的細胞檢測靶標(biāo)基因表達上升的示意圖乾闰，包含PINCR依賴和非依賴基因。
B盈滴、用5-氟尿嘧啶處理PINCR野生型和刪除細胞后檢測細胞PINCR依賴的P53靶標(biāo)基因mRNA的表達涯肩，表明5-氟尿嘧啶處理后mRNA表達增加轿钠，而PINCR刪除的細胞mRNA表達升高的比野生型的低。
C病苗、用5-氟尿嘧啶處理PINCR野生型和刪除細胞后疗垛，用P53抗體獲取細胞中與蛋白結(jié)合的DNA片段，然后進行q-pcr檢測硫朦，表明表明5-氟尿嘧啶處理后P53結(jié)合到其靶標(biāo)基因啟動子上增加贷腕，而PINCR刪除的細胞結(jié)合的比野生型的低。
D咬展、用5-氟尿嘧啶處理PINCR敲低細胞后進行q-pcr檢測PINCR和P53靶標(biāo)基因的表達泽裳，表明PINCR敲低后基因表達降低。
E-F破婆、PI染色的流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡涮总，表明PINCR敲低后細胞凋亡增加。
Figure4說明的是Matrin-3與PINCR結(jié)合作為PINCR下游效應(yīng)因子荠割。
A妹卿、RNA pull-down，用生物素標(biāo)記的PINCR探針獲取細胞中與之結(jié)合的蛋白蔑鹦，然后進行多肽光譜分析夺克，表明DOXO處理細胞后，PINCR與Matrin-3結(jié)合增加嚎朽。
B-C铺纽、RNApull-down，用生物素標(biāo)記的PINCR探針獲取DOXO處理后細胞中與之結(jié)合的蛋白哟忍，然后進行WB檢測狡门，表明PINCR與Matrin-3結(jié)合。
D锅很、RIP其馏，用Matrin-3抗體獲取5-氟尿嘧啶處理的細胞中與蛋白結(jié)合的RNA，然后進行q-pcr檢測爆安，表明PINCR與Matrin-3結(jié)合叛复。
A、將Matrin-3敲低質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PINCR-WT細胞中扔仓，然后進行WB檢測Matrin-3的表達褐奥。
B、5-氟尿嘧啶處理Matrin-3敲低質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PINCR-WT和PINCR刪除細胞翘簇，然后進行PI流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡撬码，表明Matrin-3敲低后細胞凋亡增加。
C版保、5-氟尿嘧啶處理Matrin-3敲低質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PINCR-WT和PINCR刪除細胞呜笑，然后q-pcr檢測P53靶標(biāo)基因的表達夫否，表明Matrin-3敲低后靶標(biāo)基因表達降低。
Figure5說明的是Matrin-3與P53形成復(fù)合體結(jié)合到PINCR靶標(biāo)基因的增強子區(qū)域叫胁。
A慷吊、co-IP，用Matrin-3抗體獲取與之結(jié)合的蛋白曹抬，然后進行WB檢測，表明P53與Matrin-3結(jié)合
B急鳄、co-IP谤民，用5-氟尿嘧啶處理細胞后細胞提取物分別用Rnase A和Dnase處理然后用Matrin-3抗體獲取與蛋白結(jié)合的蛋白，表明P53與Matrin-3是直接結(jié)合的疾宏。
C张足、用5-氟尿嘧啶處理PINCR-WT和PINCR刪除細胞后用Matrin-3抗體獲取與蛋白結(jié)合的DNA片段然后進行q-pcr檢測，表明5-氟尿嘧啶處理處理后Matrin-3與P53靶標(biāo)基因啟動子結(jié)合上升坎藐。
D为牍、用5-氟尿嘧啶處理Matrin-3敲低細胞然后用P53抗體獲取與P53結(jié)合的DNA片段進行q-pcr檢測，表明Matrin-3敲低不影響P53與靶標(biāo)基因啟動子結(jié)合岩馍。
E碉咆、 ChIP，用5-氟尿嘧啶處理PINCR-WT和PINCR刪除細胞后用Matrin-3抗體獲取與蛋白結(jié)合的DNA片段蛀恩，然后用q-pcr檢測P53靶標(biāo)基因的增強子區(qū)疫铜，表明5-氟尿嘧啶處理后Matrin-3與P53靶標(biāo)基因增強子結(jié)合增加。
F双谆、 用5-氟尿嘧啶處理PINCR-WT和PINCR刪除細胞后用Matrin-3抗體獲取與蛋白結(jié)合的DNA片段然后進行q-pcr檢測壳咕，表明5-氟尿嘧啶處理處理后P53與靶標(biāo)基因增強子結(jié)合上升。
G顽馋、用5-氟尿嘧啶處理Matrin-3敲低細胞然后用P53抗體獲取與P53結(jié)合的DNA片段進行q-pcr檢測谓厘，表明表明5-氟尿嘧啶處理后P53與靶標(biāo)基因增強子結(jié)合增加，而Matrin-3敲低細胞P53與靶標(biāo)基因增強子結(jié)合不增加寸谜。
參考文獻：RituChaudhary,Berkley Gryder,Wendy S Woods,et al. Prosurvival long noncoding RNAPINCR regulates a subset of p53 targets in human colorectal cancer cells bybinding to Matrin 3[J]. eLife,2017,6:e23244
