文獻(xiàn)精讀筆記

英文題目：Systematic mining and genetic characteriza据忘；tion of regulatory factors for wheat spike development

中文題目：小麥穗發(fā)育調(diào)控因子的系統(tǒng)挖掘及遺傳特性研究

通訊作者：Jun Xiao吟吝，Chinese Academy of Sciences，Beijing, China

發(fā)布時(shí)間：2022.11.11 bioRxiv

doi：10.1101/2022.11.11.516122

論文初步介紹

研究目的

小麥每穗粒數(shù)是決定單產(chǎn)的重要性狀，增加每穗小穗數(shù)能夠增加每穗粒數(shù)并最終增加產(chǎn)量揭璃，提高花序分生組織的活性和創(chuàng)制多小穗的種質(zhì)是提高小麥小穗數(shù)的有效途徑价脾，提高穗粒數(shù)是高產(chǎn)羽莺、超高產(chǎn)小麥栽培和品種選育的主攻目標(biāo)灭袁。

該文章從轉(zhuǎn)錄組學(xué)猬错、表觀遺傳學(xué)、基因組學(xué)等多組學(xué)手段茸歧，深入解析了小麥穗發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和層次關(guān)系倦炒。

摘要

① 本文將多組學(xué)數(shù)據(jù)，系統(tǒng)地探討了小麥穗發(fā)育的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)软瞎。產(chǎn)生了8個(gè)發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組圖譜逢唤。

② 作者發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)可及性和H3K27Me3組蛋白的變化與開花過(guò)程中轉(zhuǎn)錄組改變密切相關(guān)。

③ 構(gòu)建了一個(gè)核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(TRN)涤浇，該網(wǎng)絡(luò)可能驅(qū)動(dòng)各種分生組織細(xì)胞轉(zhuǎn)換形成穗鳖藕。

④ 將TRN與全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)相結(jié)合，共鑒定出260個(gè)轉(zhuǎn)錄因子只锭，其中52個(gè)是作物特有的轉(zhuǎn)錄因子著恩，但大部分未被研究。

⑤ 進(jìn)一步驗(yàn)證了TRN提出的TASPL6蜻展、TsMADS34和TAMADS14之間的多層調(diào)控模塊喉誊。TaMYB4-A可能通過(guò)調(diào)節(jié)激素穩(wěn)態(tài)或信號(hào)傳導(dǎo)從而調(diào)節(jié)可育小穗數(shù)，作用于下游并受WFZP抑制纵顾。

⑥ 在國(guó)內(nèi)育種過(guò)程中伍茄，逐漸篩選出TaMYB4-A的優(yōu)勢(shì)等位基因，表達(dá)量高施逾，小穗可育性強(qiáng)敷矫。本文為系統(tǒng)地理解小麥穗發(fā)育的遺傳調(diào)控提供了寶貴的資源和新的策略。

創(chuàng)新點(diǎn)

• 制作了轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組圖譜
• 構(gòu)建了核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
• 驗(yàn)證了穗發(fā)育過(guò)程的多重調(diào)控模塊

注釋縮寫信息補(bǔ)充

技術(shù)介紹

1. ATAC-seq:Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing音念，利用轉(zhuǎn)座酶研究染色質(zhì)可及性的高通量測(cè)序技術(shù)沪饺，屬于表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域。

真核生物的基因組DNA是被高度緊密折疊包裝的闷愤，DNA與組蛋白纏繞形成核小體整葡，串珠狀的核小體經(jīng)過(guò)螺旋折疊等方式盤繞成染色體。DNA需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄等活動(dòng)的時(shí)候讥脐，DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)才會(huì)部分解開遭居，裸露出需要與轉(zhuǎn)錄因子等反式作用元件進(jìn)行作用的DNA雙鏈（未經(jīng)組蛋白或核小體保護(hù)的DNA部位），便于轉(zhuǎn)錄旬渠。染色質(zhì)的這種特性叫做染色質(zhì)的可及性（chromatin accessibility）俱萍，而暴露的這段染色質(zhì)稱為“開放染色質(zhì)”（open chromatin），研究發(fā)現(xiàn)告丢，開放染色質(zhì)通常是轉(zhuǎn)錄因子枪蘑、增強(qiáng)子、絕緣子或者其他調(diào)控蛋白結(jié)合的片段，結(jié)合的過(guò)程仿佛是觸發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的開關(guān)岳颇，可以影響細(xì)胞內(nèi)基因復(fù)制以及調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性照捡。轉(zhuǎn)座酶可以將攜帶的DNA片段（接頭）插入開放的染色質(zhì)區(qū)域，可以得到全基因組上處于開放狀態(tài)的染色質(zhì)區(qū)域话侧。

3. RNA-seq：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)栗精，就是用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序分析，反映出mRNA,smallRNA,noncodingRNA等或者其中一些的表達(dá)水平瞻鹏。
4. H3K27me3：表觀遺傳修飾悲立，H3是組蛋白，H3K27me3表示組蛋白H3的第27個(gè)氨基酸上三甲基化新博，這是一個(gè)標(biāo)記薪夕，表明賴氨酸27三甲基化的組蛋白。
5. TRN：轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(transcriptional regulation network)是由轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors,TF)和其目標(biāo)基因的調(diào)控關(guān)系所構(gòu)成的有向網(wǎng)絡(luò)
6. WFZP：一個(gè)控制小麥穗形態(tài)的基因赫悄。New Phytologist發(fā)表了倪中福教授團(tuán)隊(duì)題為FRIZZY PANICLE defines a regulatory hub for simultaneously controlling spikelet formation and awn elongation in bread wheat的論文寥殖，其中講到WFZP抑制小穗形成但促進(jìn)芒伸長(zhǎng)相關(guān)內(nèi)容。
7. TSS：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)
8. DAPR：differential accessible promoter regions 涩蜘，差異可及啟動(dòng)子區(qū)
9. Motif：模體，基序熏纯。一段典型的序列或者一個(gè)結(jié)構(gòu)同诫。

是指構(gòu)成任何一種特征序列的基本結(jié)構(gòu)。通俗來(lái)講樟澜，即是有特征的短序列误窖，擁有生物學(xué)功能的保守序列，可能包含特異性的結(jié)合位點(diǎn)秩贰，或者是涉及某一個(gè)特定生物學(xué)過(guò)程的有共性的序列區(qū)段霹俺。基于motif序列的提取毒费，我們可以預(yù)測(cè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)丙唧。比如轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，其motif往往意味著某蛋白結(jié)構(gòu)域與DNA堿基序列的相互作用

12. TILLING：即Targeting Induced Local Lesions IN Genomes（定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)）
13. Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag)：目標(biāo)下的切割和干擾(Cut&Tag)

小麥穗部性狀

1. GNPS：grain number per spike觅玻，每穗粒數(shù)
2. SNS：spikelet number per spike 想际，每穗小穗數(shù)
3. FSPS：fertile spikelet number per spike，每穗可育的小穗數(shù)
4. DSNS：degenerated spikelet number per spike 溪厘，每穗退化的小穗數(shù)
5. FNPS：floret number per spikelet 胡本，每小穗的小花數(shù)
6. SD：spikelet density，小穗密度
7. SL：spike length 畸悬，穗長(zhǎng)
8. IM：inflorescence meristem侧甫，花序分生組織
9. SM：spikelet meristem，小穗分生組織

小麥穗發(fā)育階段

1. SAM：shoot apex meristem，頂端分生組織

2. EL：elongation stage披粟，伸長(zhǎng)期（生長(zhǎng)錐伸長(zhǎng)期）

   莖生長(zhǎng)錐伸長(zhǎng)生長(zhǎng)咒锻，長(zhǎng)度大于寬度，呈透明光滑的圓錐形僻爽。

3. SR：single edge 虫碉，單棱期（穗軸節(jié)片原基分化期）

   生長(zhǎng)錐迅速伸長(zhǎng)，生長(zhǎng)錐的基部由下而上形成像葉原基的環(huán)狀突起胸梆，即為苞葉原始體敦捧。每片苞葉原始體之間即為穗軸節(jié)片。每個(gè)苞葉原基呈棱形碰镜，故稱單棱期兢卵。

4. DR：double ridge，二棱期

   小穗原基分化期,苞葉原基發(fā)育逐漸停止绪颖，在幼穗中部?jī)蓚€(gè)相鄰苞葉原基之間最先長(zhǎng)出一個(gè)突出秽荤，即小穗原始體，呈棱形柠横，開始較小窃款，以后逐漸增大，在生長(zhǎng)錐上成長(zhǎng)大牍氛、小棱相間存在故稱二棱期晨继。

5. SMI：spikelet meristem initiation stage，小穗分生組織起始期

6. GPD：glume primordium differentiation stage 搬俊，護(hù)穎原基分化期

   幼穗中部?jī)蓚?cè)小穗原基已分化結(jié)束紊扬，頂端小穗原基逐漸分化，此時(shí)每穗小穗數(shù)基本定型,中部小穗基部形成兩個(gè)碗狀突起唉擂，后發(fā)育成穎片餐屎。

7. FMI：floral meristem initiation stage，小花分生組織起始期

8. FOP：floral organ primordia differentiation stage 小花原基分化階段

   小花原基分化先從幼穗中部玩祟，然后向上向下相繼分化腹缩。

研究結(jié)果

轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)圖譜

• 展示了穗發(fā)育的8個(gè)時(shí)期，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序RNA-seq和染色質(zhì)可及性測(cè)序ATAC-seq得出了全局基因表達(dá)空扎、染色質(zhì)可及性信息庆聘。同時(shí)，基于染色質(zhì)開放動(dòng)態(tài)勺卢，選擇SAM伙判、DR、SMI黑忱、GPD和FOP五個(gè)階段赶盔，在靶點(diǎn)和靶點(diǎn)作用下進(jìn)行組蛋白修飾分析

• 主成分分析(PCA)結(jié)果表明，這8個(gè)階段可分為兩大類哮笆，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)組包括SAM、EL冠绢、SR、DR和生殖生長(zhǎng)組包括SMI常潮、GPD弟胀、FMI和FOP

• 在DR到SMI、FMI到FOP等形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變點(diǎn)喊式，相鄰階段間差異表達(dá)基因較多

• 通過(guò)聚類方法鑒定階段特異性表達(dá)基因孵户，從具體聚類中突出了參與開花時(shí)間和花序發(fā)育的已知調(diào)控因子。例如岔留，Cluster 2中的開花時(shí)間基因TappD1在花從SAM向DR過(guò)渡之前表達(dá)夏哭。表明可以捕捉到小麥穗發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)基因表達(dá)譜。

• 可及染色質(zhì)主要位于遠(yuǎn)端基因間區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)

• PCA分析揭示小麥穗發(fā)育過(guò)程中染色質(zhì)可及性動(dòng)態(tài)的變化軌跡

• 從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到開花過(guò)渡和花序萌發(fā)過(guò)程中献联，染色質(zhì)的可及性總體呈上升趨勢(shì)竖配，而在小穗和小花形成過(guò)程中，染色質(zhì)的可及性呈下降趨勢(shì)里逆。

• 主成分分析和聚類分析表明进胯，在不同發(fā)育階段，不同組蛋白修飾具有階段特異性的轉(zhuǎn)變原押。

• 值得注意的是龄减，H3K27Me3呈現(xiàn)連續(xù)軌跡，而其他的則不是班眯，可能具有較高的相關(guān)性。

• H3K27Me3和染色質(zhì)可及性共同影響穗發(fā)育過(guò)程中不同基因的表達(dá)模式

染色質(zhì)環(huán)境對(duì)調(diào)控的影響

• 共鑒定出49,153個(gè)DAPR（差異可及啟動(dòng)子區(qū)）烁巫，分為6個(gè)cluster署隘。 其中，大多數(shù)在DR期或SMI期表現(xiàn)出更高的可及性亚隙。
• 圖B中2,3,4,6這四個(gè)基因簇的染色質(zhì)可及性與轉(zhuǎn)錄表達(dá)能力呈較高的正相關(guān)磁餐。
• 通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)量增加的基因顯著重疊阿弃，染色質(zhì)可及性增加的程度與表達(dá)水平升高的變化高度相關(guān)诊霹。

• 對(duì)基因集I中的基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)激素合成和信號(hào)傳遞渣淳、花序分生組織發(fā)育脾还、細(xì)胞分裂不對(duì)稱性相關(guān)基因富集程度較高。
• 熱圖結(jié)果表明在營(yíng)養(yǎng)頂端分生組織向花序分生組織過(guò)渡過(guò)程中入愧，染色質(zhì)可及性的增加與基因表達(dá)的提高是同步的
• 基因集II雖然在SMI和GPD階段染色質(zhì)可及性提高鄙漏，但相對(duì)開放程度較低嗤谚。結(jié)果表明，隨著H3K27Me3基因表達(dá)水平的降低怔蚌，如WAP3基因表達(dá)水平逐漸升高巩步，這可能是H3K27Me3啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的原因之一。對(duì)于基因集III桦踊，可以發(fā)現(xiàn)其染色質(zhì)可及性最低和H3K27ME3組蛋白修飾覆蓋度最高椅野，限制了基因的激活，就像TAEHD2基因一樣籍胯。

基因共表達(dá)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

隨著生殖生長(zhǎng)（DR）的開始竟闪，依次經(jīng)歷SMI、GPD芒炼、FMI和FOP過(guò)程形成穗結(jié)構(gòu)瘫怜，這是決定SNS每穗小穗數(shù)的關(guān)鍵，有助于糧食產(chǎn)量本刽。 因此鲸湃，作者分析了基因共表達(dá)情況和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，目的是找出控制這一過(guò)程的潛在因素子寓。

• 作者基于PCA的距離計(jì)算了SMI到FOP階段的偽時(shí)間暗挑，發(fā)現(xiàn)GPD期和FMI期（前半段）相對(duì)比較接近

• 在穗結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中，在四個(gè)階段里一共鑒定出了8200個(gè)基因差異表達(dá)DGE斜友，分為6個(gè)不同的簇cluster炸裆。

• • 花分生組織和各種激素代謝基因在SMI中高表達(dá)；

  • 激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鲜屏、極性建立相關(guān)基因在GPD和FMI中高表達(dá)烹看；

  • 在花器官發(fā)育方面，極性控制基因在FOP時(shí)高表達(dá)洛史。

    1. 同時(shí)惯殊，發(fā)現(xiàn)在第3簇和第6簇內(nèi)，ERF和WRKY轉(zhuǎn)錄因子TFS在SMI期富集并高表達(dá)也殖。

    2. 這種基因表達(dá)模式符合時(shí)空特征土思，并說(shuō)明了單個(gè)TFs家族在調(diào)控穗發(fā)育過(guò)程轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)中的潛在重要性。

• 可及性較高的染色質(zhì)區(qū)域能為TF的結(jié)合提供對(duì)接位點(diǎn)忆嗜，在圖中己儒，可以看出ERF、BHLH和SPL的結(jié)合基序（模體）在SMI與FOP的結(jié)合過(guò)程中可及性變異程度最大捆毫，說(shuō)明這些TFs轉(zhuǎn)錄因子具有的潛在重要性闪湾。

• 從SMI到FMI的時(shí)間序列表達(dá)基因簇之間存在明顯的序列調(diào)控關(guān)系，即C6-C3-C2-C4绩卤。而在C1和C5中响谓，F(xiàn)OP特異表達(dá)的基因是相互分離調(diào)控的损合。表明小穗和小花發(fā)育之間存在不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

• 從圖中可以看出ERF、B3娘纷、TCP等TFs可能在該網(wǎng)絡(luò)中起核心調(diào)控作用

• 在該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中可以找到一些與小麥穗發(fā)育有關(guān)的調(diào)節(jié)因子嫁审，比如：TaTB1、VRN1赖晶。表明了作者構(gòu)建出來(lái)的TRN網(wǎng)絡(luò)在發(fā)掘重要調(diào)節(jié)因子方面的能力律适。

• 接下來(lái)，作者為了驗(yàn)證TFs之間轉(zhuǎn)錄調(diào)控層次的預(yù)測(cè)能力遏插，提取了一個(gè)小模塊捂贿，其中包含了在其他作物中單獨(dú)進(jìn)行功能研究但尚未知道調(diào)控關(guān)系的因子，比如SPL6胳嘲、MADS34厂僧。即紅框中這些因子

• 作者推測(cè)在SPL6-MADS34-MADS15-HMA模塊后有一個(gè)正的轉(zhuǎn)錄調(diào)控體系，通過(guò)熒光素酶報(bào)告檢測(cè)了牛，在煙草葉片中觀察到它們之間存在一個(gè)正轉(zhuǎn)錄調(diào)控回路颜屠。

多組學(xué)數(shù)據(jù)挖掘調(diào)控因子

染色質(zhì)的開放區(qū)域是建立轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系的關(guān)鍵

• 多數(shù)TFs結(jié)合基序存在于染色質(zhì)的開放區(qū)域。
• 在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合中心區(qū)域鹰祸，DNA的變異程度明顯降低甫窟。
• 在開放染色質(zhì)區(qū)域含有明顯較高的GWAS信號(hào)，這些信號(hào)與穗形態(tài)特征相關(guān)蛙婴。
• 開放染色質(zhì)區(qū)的QTL頻率是全基因組QTL頻率的5倍粗井，GNPS、SNS等許多性狀均有類似結(jié)果街图。

• 作者以每穗可育小穗數(shù)FSPS為例浇衬，經(jīng)GWAS分析，共有153個(gè)顯著相關(guān)位點(diǎn)餐济，將候選區(qū)間擴(kuò)大到以GWAS信號(hào)峰為中心的1兆比MB,共鑒定出2916個(gè)候選基因耘擂。其中有1762個(gè)基因(C1和C4)在DR和SMI階段的染色質(zhì)可及性開放程度最高，這可能與小穗原基的分化有關(guān)颤介，最終影響小穗數(shù)。這一結(jié)果表明赞赖，大部分GWAS候選基因在與相應(yīng)性狀關(guān)鍵發(fā)育階段具有較高的染色質(zhì)開放度滚朵。
• 一共6000多個(gè)基因，以轉(zhuǎn)錄因子TFS編碼基因?yàn)橐笄坝颍玫?code>776個(gè)候選基因進(jìn)行進(jìn)一步篩選辕近，其中，超過(guò)一半（404個(gè)TFs）位于穗發(fā)育相關(guān)的遺傳區(qū)域內(nèi)匿垄。然后通過(guò)尋找開放染色質(zhì)區(qū)域中的SNP來(lái)進(jìn)一步將候選TFs縮小到260個(gè)移宅，它們可能影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控回路归粉，并重新連接穗發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)TRN

• 在候選TFs中，分為三類:第一類在小麥中功能已經(jīng)被研究漏峰，第二類在其他物種中已被研究糠悼，稱其為“保守型”，第三類在小麥和其他作物中功能未知浅乔，稱其為“新型”
• 值得注意的是倔喂，大多數(shù)是“新型”轉(zhuǎn)錄因子TFs，多達(dá)208個(gè)靖苇，它們沒(méi)有在小麥或其他作物中研究過(guò)席噩。 這些轉(zhuǎn)錄因子TFs在ERF、WRKY贤壁、BHLH悼枢、MYB、B3家族中富集脾拆。

驗(yàn)證調(diào)控因子遺傳結(jié)構(gòu)

在保守型調(diào)控因子中馒索，TaSPL6, TaMADS34, TaMADS15同樣出現(xiàn)在之前提到的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，因此假丧，作者接來(lái)來(lái)驗(yàn)證它們是否會(huì)參與穗發(fā)育過(guò)程双揪。

• 通過(guò)原位雜交技術(shù)展示了這些調(diào)控因子時(shí)空表達(dá)模式，TaSPL6包帚，TaMADS34和 TaMADS15在SAM期弱表達(dá)渔期，而在SMI和FOP期高表達(dá)。TaHMA是TaMADS15的下游靶位點(diǎn)渴邦，在FOP小花原基中也有表達(dá)疯趟。相似的時(shí)空表達(dá)模式說(shuō)明它們?cè)谒氚l(fā)育中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)和潛在作用。
• 然后作者對(duì)這三個(gè)調(diào)控因子進(jìn)行RNAi沉默信峻，得到轉(zhuǎn)基因植株瓮床，34和15（后兩個(gè)）表現(xiàn)出相似的表型變化，穗長(zhǎng)SL縮短
• 每穗小穗數(shù)SNS降低
• 穗粒數(shù)GNPS降低

• 在TasPL6-RNAi轉(zhuǎn)基因小麥中隘庄，觀察到TaMADS34的表達(dá)顯著降低，進(jìn)一步表明TaSPL6正向調(diào)節(jié)TaMADS34获印，另外后續(xù)的調(diào)控過(guò)程也相類似。證明TASPL6-TAMADS34-TAMADS15-TAHMA模塊在小麥穗發(fā)育過(guò)程中具有調(diào)控功能街州。
• 然后從進(jìn)化的角度進(jìn)一步分析了小麥和禾本科中TASPL6-TAMADS34-TAMADS15-TAHMA調(diào)控模塊玻孟，在二倍體鳍征、四倍體蟆技、六倍體小麥中，發(fā)現(xiàn)在MADS15同源基因的啟動(dòng)子區(qū)均存在一個(gè)MADS34結(jié)合模體旺聚，同時(shí)砰粹，在附圖5C中碱璃，可以得出在MADS34同源基因的啟動(dòng)子區(qū)存在SPL6的結(jié)合模體饭入，表明該調(diào)控模塊可能在小麥中保守谐丢。
• 然而乾忱，在水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea Mays）中，MADS15的啟動(dòng)子區(qū)沒(méi)有MADS34的結(jié)合模體衷佃，MADS34的啟動(dòng)子區(qū)也沒(méi)有SPL6的結(jié)合模體氏义，說(shuō)明該調(diào)控模塊在禾本科植物中可能存在差異图云。

驗(yàn)證新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控因子

作者為了驗(yàn)證該模型在識(shí)別新型小麥穗發(fā)育調(diào)節(jié)因子方面的能力琼稻，研究了Kronos帕翻、Cadenza嘀掸、KN9204的Meta Tilling突變系的穗發(fā)育缺陷睬塌，將其突變位點(diǎn)經(jīng)全外顯子測(cè)序鑒定揩晴。

全外顯子測(cè)序：利用序列捕獲技術(shù)將全基因組中所有外顯子區(qū)域DNA序列捕獲，富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的方法诅愚∥バⅲ可用于研究已知基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)雌桑、插入缺失位點(diǎn)等校坑，不適合用于研究基因組結(jié)構(gòu)的變異衅鹿。

• 在208個(gè)新型TFs中制妄，131個(gè)TFs包含至少有一個(gè)功能缺失突變的突變系
• 在85個(gè)純合突變株系中泵三，有44個(gè)TFs在三種類型中表現(xiàn)出穗發(fā)育缺陷,分別是：
  1. 第一組：開花時(shí)間差異
  2. 第二組：小穗或小花退化差異
  3. 第三組：穗長(zhǎng)或每穗小穗數(shù)差異
• 圖C和D展示了不同類型的突變系烫幕，可以得出：
  1. TaCAMTA-A突變體的開花時(shí)間比對(duì)照提前了兩周左右
  2. TaWRKY37-A突變體的退化小穗數(shù)顯著增多较曼，導(dǎo)致穗粒數(shù)降低
  3. TabHLH009-A突變體突變體穗長(zhǎng)縮短，小穗密度增加

• 在四倍體小麥Kronos的功能缺失突變體TaNAC22-A中冕末，由于花原基分化沒(méi)有正常終止档桃，所以每個(gè)小穗的小花數(shù)增加藻肄。但是多數(shù)小花敗育嘹屯，最終導(dǎo)致穗粒數(shù)GNPS降低抚垄。
• 通過(guò)原位雜交進(jìn)一步證實(shí)了這些基因的時(shí)空表達(dá)模式谋逻，TaWRKY37-A毁兆、TabHLH009-A和TanAC22-A基因均在小穗發(fā)育起始期和花原基分化期气堕，與它們的表型缺陷一致茎芭。
  • TaWRKY37-A在穗基部和小花分生組織中高表達(dá)
  • TaBHLH009-A在穗上部和小花分生組織中高表達(dá)
  • TaNAC22-A在小花原基中有顯著表達(dá)梅桩。

TaMYB4-A對(duì)穗發(fā)育的影響

為了進(jìn)一步了解TRN和GWAS技術(shù)在單個(gè)基因分子功能研究中的應(yīng)用前景宿百，作者選取了一個(gè)新型調(diào)控因子TaMYB4-A進(jìn)行深入的研究垦页。TaMYB4-A是TRN中的TFs之一（在前期調(diào)控階段）

• 通過(guò)GWAS分析痊焊，發(fā)現(xiàn)它位于一個(gè)與每穗可育小穗數(shù)FSPS顯著相關(guān)的區(qū)間內(nèi)。

• 它的兩種單倍型（C型和T型）可分離出214個(gè)小麥自然群體炭菌，它們的每穗可育小穗數(shù)FSPS具有差異顯著。

• 通過(guò)原位雜交發(fā)現(xiàn)TaMYB4-A在DR期的小穗分生組織初步表達(dá)酌毡，在SMI期和FMI期的小穗和小花原基中高表達(dá)枷踏，說(shuō)明它在確定小穗數(shù)中起作用旭蠕。

• 作者從KN9204掏熬、Cadenza中找到了TaMYB4-A功能缺失突變體旗芬，發(fā)現(xiàn)突變后SL捆蜀、SNS辆它、GNPS顯著降低锰茉，進(jìn)一步證實(shí)了它在調(diào)節(jié)小穗發(fā)育中的作用飒筑。

• 熒光素酶報(bào)告檢測(cè)得出在TaMYB4-A的潛在上游調(diào)節(jié)因子中扬霜，WFZP和DOF型TF TADOF17(Traescs2B02G592700)分別能抑制或激活煙草中的TaMYB4-A著瓶。

  1. TaAP2-39：通過(guò)控制ABA/GA平衡調(diào)控水稻分蘗和穗/花序的發(fā)育

  2. TaI-BAK1：與油菜素甾體激酶相關(guān)，在水稻中過(guò)量表達(dá)可增加穗長(zhǎng)和每穗粒數(shù)

  3. TaPILS7：編碼生長(zhǎng)素載體成分

  上面三個(gè)基因在穗形成過(guò)程中表現(xiàn)出與TaMYB4-A同步的時(shí)空表達(dá)模式

• WFZP高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小麥中TaMYB4-A的表達(dá)量下調(diào)季眷，進(jìn)一步證明了WFZP對(duì)TaMYB4-A的抑制作用

• 小麥TaMYB4-A的遺傳網(wǎng)絡(luò)

TaMYB4-A關(guān)鍵SNP變異影響

最后子刮，作者想知道TaMYB4-A的不同單倍型是如何影響小麥穗部結(jié)構(gòu)挺峡，因此進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析

• SNP-939(C/T)變異位點(diǎn)位于TaMYB4-A的啟動(dòng)子區(qū)，而且剛好在WFZP核心結(jié)合基序的下方狭姨。該位置的SNP變異可能通過(guò)影響WFZP結(jié)合從而導(dǎo)致TaMYB4-A表達(dá)差異饼拍。

• 通過(guò)對(duì)保守基序的識(shí)別惕耕，證實(shí)了WFZP對(duì)TamyB4-A的抑制作用诫肠，在熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)中栋豫，發(fā)現(xiàn)煙草葉片的C→T突變消除了這種抑制作用

• 作者進(jìn)一步選擇了兩種類型（C型和T型）的33個(gè)不同小麥品種丧鸯，測(cè)定了TaMYB4-A的表達(dá)量和穗形態(tài)

  • C型：表現(xiàn)出優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，即SL較長(zhǎng)围肥，F(xiàn)SPS較多穆刻，TaMYB4-A表達(dá)水平顯著較高
  • T型：表現(xiàn)出SL較短氢伟，F(xiàn)SPS較少朵锣，TaMYB4-A表達(dá)水平較低诚些。

  這一結(jié)果為SNP變異引起TaMYB4-A表達(dá)水平差異進(jìn)而影響SL和FSPS提供了遺傳學(xué)依據(jù)

• 此外诬烹，作者還想知道TaMYB4-A啟動(dòng)子中的C/T變異位點(diǎn)是如何在我國(guó)育種過(guò)程中被選擇的椅您。于是基于中國(guó)小麥微型核心種質(zhì)的外顯子捕獲測(cè)序數(shù)據(jù)掀泳，得出：

• 相比于引進(jìn)品種（45.45%） ，我國(guó)地方品種（82.08%）和現(xiàn)代品種（78.18%）攜帶C型等位基因的種質(zhì)比例較高藕畔。

• 隨著育種時(shí)間推移注服，C型的等位基因頻率顯著升高溶弟，表明TaMYB4-A的C型基因在我國(guó)育種過(guò)程中得到了廣泛的應(yīng)用 辜御，尤其是1978年以后擒权。

• 自1950年以來(lái)碳抄，骨干親本在我國(guó)廣泛應(yīng)用于小麥品種改良剖效，包括Zhoumai16, St2422/464, Nanda2419,Nanda2419, St2422/464, Funo, Xiaoyan6, Aimengniu, Zhou8425B, Abbondanza and Lovrin10（圖中的十個(gè)品種），21個(gè)骨干親本中有17個(gè)在SNP-939位點(diǎn)為C型姨谷，除了Aimengniu 和 Lovrin10，這兩個(gè)親本的衍生品種在我國(guó)廣泛種植捌议，這些衍生品種更傾向于從另一個(gè)親本中保留SNP-939的C型瓣颅。

• 該圖是SNP-939在中國(guó)不同生態(tài)區(qū)的等位基因的比例宫补，中國(guó)主要小麥種植區(qū)的等位基因具有明顯的分布特征粉怕，以下為T型的占比情況：

  • 春小麥區(qū)相對(duì)較多(≥40%贫贝，VI, VII, VIII）

  • 其次是冬春混合區(qū)（IX和X稚晚，分別為22.22%和23.08%）

  • 在冬麥區(qū)(I蜈彼、II幸逆、III还绘、IV拍顷、V)出現(xiàn)頻率較低(<20%)

    因此昔案，TaMYB4-A的C型等位基因可能來(lái)源于中國(guó)地方種質(zhì)踏揣，在育種過(guò)程中被廣泛應(yīng)用

討論部分

小麥?zhǔn)亲钤绫获Z化的作物之一捞稿，馴化與穗部結(jié)構(gòu)變化聯(lián)系在一起娱局，以利于收獲和提高產(chǎn)量衰齐。提高產(chǎn)量也是育種的主要目標(biāo)之一耻涛。 對(duì)于谷類作物來(lái)說(shuō)犬第，穗結(jié)構(gòu)通過(guò)影響小穗和小花的發(fā)育歉嗓，在很大程度上決定著籽粒數(shù)量,研究控制穗部結(jié)構(gòu)的分子機(jī)制將有助于設(shè)計(jì)育種過(guò)程.

作者制作了一個(gè)基于時(shí)間序列的表觀基因組圖譜，包括從營(yíng)養(yǎng)發(fā)育到生殖生長(zhǎng)過(guò)程中各種類型的組蛋白修飾志珍，染色質(zhì)可及性變化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)伦糯，這將為系統(tǒng)研究小麥穗發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)資源敛纲。

總之淤翔，作者結(jié)合多組學(xué)數(shù)據(jù)揭示了小麥穗發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)TRN和表觀遺傳變化监嗜。結(jié)合GWAS分析裁奇，作者發(fā)現(xiàn)了幾十個(gè)影響小穗結(jié)構(gòu)的新調(diào)控因子框喳，揭示了TaMYB4-A啟動(dòng)子內(nèi)WFZP結(jié)合位點(diǎn)的SNP變異在我國(guó)小麥育種過(guò)程中起著關(guān)鍵作用五垮。

材料與方法

材料：冬小麥品種KN9204

環(huán)境：溫室

取樣：在8個(gè)發(fā)育階段放仗，各取10-50個(gè)小穗

轉(zhuǎn)基因植株

利用冬小麥品種KN9204進(jìn)行基因序列擴(kuò)增诞挨，春小麥品種Fielder獲得轉(zhuǎn)基因小麥植株

測(cè)序數(shù)據(jù)處理

• reference genome：Chinese Spring-RefSeq v1.0
• FastQC v0.11.8：for ensure the high quality of reads
• BWA-MEM v0.7.17：for ATAC-seq and CUT&Tag seq
• hisat2：短序列比對(duì)工具，主要用于RNAseq數(shù)據(jù)的比對(duì)
• Samtools v1.4：進(jìn)行索引银室、排序蜈敢、過(guò)濾
• Picard v2.23.3：刪除讀數(shù)中重復(fù)項(xiàng)
• deepTools v3.3.0：數(shù)據(jù)規(guī)范化可視化

RNA數(shù)據(jù)分析

• Counts v2.0.1：計(jì)數(shù)
• DESeq2 v1.26.0：差異表達(dá)分析
• ComplexHeatmap (v2.4.3)：聚類抓狭、可視化
• clusterProfiler v3.18.1：基因功能富集

ATAC-seq數(shù)據(jù)分析

• MACS2 v2.1.4：調(diào)用峰
• ChIPseeker v1.26.2：注釋峰
• HINT tool v0.13.2：鑒定轉(zhuǎn)錄因子變化情況

差異染色質(zhì)修飾富集區(qū)檢測(cè)

• DiffBind v2.16.2：計(jì)算峰值讀數(shù)

構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

1. 通過(guò)PCA分析對(duì)穗發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的基因進(jìn)行分組
2. 計(jì)算相鄰組之間的歐幾里得距離
3. 進(jìn)行坐標(biāo)縮放，計(jì)算基因的擬合曲線
4. 根據(jù)基因表達(dá)情況和標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)苗桂，對(duì)每個(gè)基因進(jìn)行PCA分析

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

• 利用水稻MADS34和MADS15蛋白序列鑒定小麥和玉米中的同源基因
• MUSCLE v3.8.1551：序列比對(duì)
• trimAl v1.4.rev15：篩選氨基酸位置
• RAxML v8.2.12：構(gòu)建最大似然系統(tǒng)發(fā)生樹

GWAS全基因組關(guān)聯(lián)分析

• 214份小麥660K單核苷酸序列中篩選出319,558個(gè)單核苷酸序列與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析
• Tassel v5.2
• CMplot：Manhattan plots and quantile-quantile plots

基于基因的關(guān)聯(lián)分析

利用287份中國(guó)小麥微型核心種質(zhì)的全基因組外顯子捕獲測(cè)序數(shù)據(jù)誉察，確定了TaMYB4-A基因6kb區(qū)的單核苷酸多態(tài)性驼卖，包括外顯子區(qū)酌畜、內(nèi)含子區(qū)桥胞、4kb啟動(dòng)子區(qū)和0.5kb 3'-UTR區(qū)贩虾。

• Haploview 4.2：計(jì)算連鎖不平衡缎罢，制作LD圖

數(shù)據(jù)獲取

• Genome Sequence Archive：https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa
• PRJCA013096

熒光素酶實(shí)驗(yàn)

LUC熒光素酶，可以極其靈敏考杉、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)策精。是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法。

熒光素酶基因報(bào)告是指以熒光素(luciferin)為底物來(lái)檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報(bào)告系統(tǒng)崇棠。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin咽袜，在luciferin氧化的過(guò)程中，會(huì)發(fā)出生物熒光询刹，是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法。

原位雜交

原位雜交技術(shù)的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列抽莱，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織范抓、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)配對(duì)骄恶，結(jié)合成專一的核酸雜交分子食铐，經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來(lái)僧鲁。

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