Nature | 病毒衍生腫瘤相關(guān)抗原識別和表征腫瘤反應(yīng)性CD8 T細(xì)胞

原創(chuàng)?huacishu圖靈基因今天

收錄于話題#前沿分子生物學(xué)機(jī)制

撰文：huacishu

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亮點(diǎn)：

1惯雳、研究表明在HPV陽性HNSCC患者中存在對PD-1定向免疫治療有反應(yīng)的細(xì)胞機(jī)制。

2、本研究表明E2和E5是HPV陽性HNSCC患者腫瘤內(nèi)CD8 T細(xì)胞反應(yīng)的主要靶點(diǎn)。

3、對HPV陽性HNSCC患者CD8 T細(xì)胞反應(yīng)的研究濒持，可以作為其他病毒介導(dǎo)癌癥免疫反應(yīng)分析的基準(zhǔn)。

美國埃默里大學(xué)Winship癌癥研究所Rafi Ahmed教授團(tuán)隊(duì)在國際知名期刊Nature在線發(fā)表題為“Functional HPV-specific PD-1+stem-like CD8 T?cells in head and neck cancer”的研究論文。慢性病毒感染和癌癥導(dǎo)致CD8 T細(xì)胞功能受損不见，其特征是多種抑制性受體（包括PD-1）的表達(dá)。阻斷PD-1抑制途徑可增強(qiáng)T細(xì)胞功能崔步，是多種癌癥的有效治療方法稳吮。臨床前研究表明，一種獨(dú)特的PD-1+TCF-1+干細(xì)胞樣CD8 T細(xì)胞亞群在慢性感染期間維持CD8 T細(xì)胞反應(yīng)井濒，并在PD-1定向免疫治療后提供源源不斷的增殖灶似。在人類腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了類似的PD-1+TCF-1+CD8 T細(xì)胞。然而瑞你，需要更好地定義其抗原特異性及其與腫瘤中其他CD8 T細(xì)胞亞群的譜系關(guān)系酪惭，以了解人類癌癥中的T細(xì)胞分化途徑并優(yōu)化免疫治療方法。本研究通過分析頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）中HPV特異性CD8 T細(xì)胞來解決上述問題捏悬。

為了研究CD8 T細(xì)胞對HNSCC的反應(yīng)撞蚕，從未接受治療的HPV陽性HNSCC隊(duì)列中的12名患者的6個原發(fā)腫瘤和8個轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中鑒定了TIL。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測过牙，CD8 T細(xì)胞約占TIL的30%（圖1a）甥厦。大多數(shù)CD8 TIL表達(dá)高水平的PD-1，所有PD-1+細(xì)胞均為CD45RA陰性（圖1a）寇钉。這些PD-1+CD45RA?CD8 T細(xì)胞包括表達(dá)TCF-1或TIM-3的不同群體（圖1b）刀疙，這些標(biāo)記通常用于區(qū)分干細(xì)胞樣細(xì)胞（TCF-1+TIM-3?)?和終末分化（TIM-3+TCF-1?) PD-1+CD8T細(xì)胞。雖然患者之間差異很大扫倡，但平均45%的PD-1+細(xì)胞表現(xiàn)出終末分化表型谦秧。所有患者均存在干細(xì)胞樣PD-1+TCF-1+CD8 T細(xì)胞竟纳，與TIM-3+細(xì)胞相比，其顆粒酶B疚鲤、Ki-67和CD39的表達(dá)水平顯著降低（圖1b）锥累。這兩個亞群都表達(dá)TOX，TOX是慢性病毒感染和癌癥期間CD8 T細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子集歇。接下來桶略，使用多重免疫組織化學(xué)方法檢查了原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中這些PD-1+CD8 T細(xì)胞亞群的解剖位置。CD8+和PD-1+細(xì)胞廣泛存在于細(xì)胞角蛋白陽性的腫瘤實(shí)質(zhì)以及腫瘤周圍的基質(zhì)中（圖1c）诲宇。值得注意的是际歼，PD-1+TCF-1+細(xì)胞主要存在于間質(zhì)區(qū)域，很少出現(xiàn)在腫瘤實(shí)質(zhì)中（圖1d姑蓝，e）鹅心，而分化程度較高的細(xì)胞則分散在腫瘤微環(huán)境（TME）中，這表明干細(xì)胞樣細(xì)胞位于TME內(nèi)纺荧，遠(yuǎn)離腫瘤本身旭愧。

HPV陽性HNSCC提供了使用一組確定的病毒衍生腫瘤相關(guān)抗原來識別和表征腫瘤反應(yīng)性CD8 T細(xì)胞的機(jī)會。作者重點(diǎn)研究了已知的HPV癌基因E5虐秋、E6和E7榕茧，以及參與HPV基因組表位維持的E2。為了鑒定HPV衍生的CD8 T細(xì)胞表位客给，使用251個預(yù)測的HPV培養(yǎng)HNSCC患者的外周血單個核細(xì)胞（PBMC）2周用押，然后使用干擾素-γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)（ELISpot）檢測擴(kuò)增的PBMC中T細(xì)胞的反應(yīng)性（圖2a，b）靶剑◎卟Γ總的來說，ELISpot鑒定出43種不同的肽（22種HPV E2肽桩引、10種HPV E5肽缎讼、9種HPV E6肽和2種HPV E7肽），多個患者的T細(xì)胞可識別多個表位坑匠。通過對從原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)分離的TIL進(jìn)行四聚體染色血崭，可以在體外檢測到HPV特異性CD8 T細(xì)胞，并且所有這些細(xì)胞都表達(dá)高水平的PD-1（圖2c）厘灼。不同患者之間HPV特異性CD8 T細(xì)胞的頻率不同夹纫，從CD8 TIL的0.1%到10%不等，但在同一個體的原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中设凹，CD8 T細(xì)胞到給定表位的頻率相似（圖2c舰讹，d）∩林欤總之月匣，這些數(shù)據(jù)表明钻洒，在HPV陽性的HNSCC中，HPV特異性CD8 T細(xì)胞可以占CD8 TIL的很大比例锄开，并且盡管具有相同抗原特異性的細(xì)胞可以從PBMC中擴(kuò)增出來素标，但在穩(wěn)態(tài)條件下，它們在血液中的頻率要低得多院刁。

從7例原發(fā)性腫瘤和6例轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中分離出HPV四聚體陽性CD8 TIL糯钙，并通過單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）檢測其轉(zhuǎn)錄特征。HPV特異性CD8 TIL由三個轉(zhuǎn)錄不同的集群組成退腥，在數(shù)百個基因的表達(dá)上彼此不同（圖3a）。所有的集群表達(dá)TOX-a轉(zhuǎn)錄因子再榄，該轉(zhuǎn)錄因子對于在T細(xì)胞和抑制分子PDCD1狡刘、CTLA4和TIGIT中建立表觀遺傳狀態(tài)至關(guān)重要（圖3b）。集群1細(xì)胞的特征是TCF7的高水平表達(dá)困鸥，TCF7是慢性病毒感染期間產(chǎn)生干細(xì)胞樣CD8 T細(xì)胞所必需的轉(zhuǎn)錄因子嗅蔬。集群1細(xì)胞也表達(dá)LEF1，另一種與干細(xì)胞樣T細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子疾就；T細(xì)胞存活所需的IL7R澜术；CCR7，參與淋巴組織歸巢的主要受體猬腰；以及XCL1和GPR183（EBI2）鸟废，這兩種分子與樹突狀細(xì)胞的遷移和募集有關(guān)。集群2中的HPV特異性CD8 T細(xì)胞的特征是PRDM1和幾種其他轉(zhuǎn)錄因子的高表達(dá)姑荷，這些轉(zhuǎn)錄因子通常與急性T細(xì)胞受體（TCR）結(jié)合有關(guān)盒延，如NR4A1（NUR77）、FOS和JUN鼠冕，表達(dá)最高水平的IFNG添寺。在集群2和集群3中發(fā)現(xiàn)效應(yīng)分子如GZMA、GZMB懈费、PRF1和GNLY的表達(dá)计露，并且這些集群還表達(dá)抑制性受體如HAVCR2（TIM-3）和ENTPD1（CD39）。上述分析包括來自不同患者憎乙、來自原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位的HPV特異性CD8 T細(xì)胞票罐，以及不同的表位特異性。對HPV特異性CD8 TIL的單獨(dú)分析顯示寨闹，這些細(xì)胞在已識別的集群中的分布具有可比性胶坠，與樣本來源和表位特異性無關(guān)（圖3c）。此外繁堡，將HPV特異性CD8 TIL與原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)分開聚集沈善，可產(chǎn)生具有可比性的集群乡数，相應(yīng)集群之間的基因表達(dá)差異最小，表明HPV特異性CD8 TIL在原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位的分化狀態(tài)非常相似闻牡。HPV特異性PD-1+CD8 TIL的流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)一步證實(shí)TME中存在TCF-1+干細(xì)胞樣細(xì)胞和更多終末分化細(xì)胞净赴，TCF-1+細(xì)胞表達(dá)高水平的CD28和低水平的顆粒酶B和TIM-3。

HPV特異性CD8 TIL的TCR序列顯示每個四聚體的TCR克隆型占優(yōu)勢罩润。來自個體患者原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位的配對scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示玖翅，兩個部位的特定克隆型頻率之間存在相關(guān)性。最重要的是割以，HPV特異性CD8 T細(xì)胞在三個集群之間顯示出顯著程度的TCR克隆重疊（圖4）金度。事實(shí)上，在干細(xì)胞樣严沥、暫時性和終末分化的HPV特異性CD8 T細(xì)胞中猜极，最顯性和不太顯性的克隆型分布相似。研究分析的所有HPV特異性四聚體分類的CD8 T細(xì)胞都出現(xiàn)了這種情況消玄。

為了提供所提出的譜系關(guān)系模型的直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)跟伏，檢測了HPV特異性PD-1+干細(xì)胞樣細(xì)胞和終末分化的CD8 T細(xì)胞在體外用同源HPV肽刺激后增殖和分化的潛力。直接從腫瘤中提取TIL翩瓜，用細(xì)胞追蹤紫羅蘭（CTV）標(biāo)記受扳，然后根據(jù)表面標(biāo)記物PD-1、TIM-3和CD39的表達(dá)兔跌，通過流式細(xì)胞術(shù)將CTV標(biāo)記的CD8 TIL分類為干細(xì)胞樣（PD-1+TIM-3?CD39?)?和終末分化（PD-1+TIM-3+CD39+）CD8 T細(xì)胞（圖5a）勘高。然后，將兩個分類的PD-1+亞群在患者匹配的自體PBMC中培養(yǎng)五天浮定。在缺乏HPV肽的情況下相满，從腫瘤中分離出的干細(xì)胞樣或終末分化的CD8 T細(xì)胞幾乎沒有增殖（圖5b）。然而桦卒，用HPV肽刺激干細(xì)胞樣細(xì)胞導(dǎo)致HPV特異性四聚體陽性CD8 T細(xì)胞的廣泛增殖立美，這些細(xì)胞經(jīng)歷多達(dá)七次分裂。相比之下方灾，只有極少數(shù)當(dāng)用相同的肽脈沖PBMC刺激最終分化的HPV特異性CD8 T細(xì)胞時建蹄，未觀察到增殖（圖5b）。通過復(fù)制指數(shù)測量的所有七個樣本均觀察到HPV特異性干細(xì)胞樣CD8 T細(xì)胞的優(yōu)越增殖能力（圖5c）裕偿。這些結(jié)果清楚地表明洞慎，腫瘤中存在的HPV特異性PD-1+干細(xì)胞樣CD8 T細(xì)胞具有增殖潛能，而分化程度更高的HPV特異性CD8 T細(xì)胞在抗原刺激后已喪失分裂能力嘿棘。接下來劲腿，研究了抗原誘導(dǎo)的HPV特異性干細(xì)胞樣CD8 T細(xì)胞增殖是否與分化為更多終末分化細(xì)胞有關(guān)。在沒有抗原刺激的情況下培養(yǎng)的干細(xì)胞樣CD8 T細(xì)胞表達(dá)低水平的TIM-3鸟妙、顆粒酶B和CD39焦人，因此維持其體內(nèi)表型（圖5d）挥吵。然而，用同源HPV肽刺激這些HPV特異性干細(xì)胞樣CD8 T細(xì)胞導(dǎo)致四聚體陽性增殖CD8 T細(xì)胞顯著上調(diào)TIM-3花椭、顆粒酶B和CD39（圖5d）忽匈。值得注意的是，HPV特異性PD-1+干細(xì)胞樣CD8 T細(xì)胞表達(dá)CD45RO亞型矿辽，與基于CD45RA表達(dá)定義的人類干細(xì)胞樣記憶CD8 T（TSCM）細(xì)胞不同丹允。

該研究結(jié)果主要在三個方面有意義：第一，基于PD-1的HPV陽性HNSCC患者治療袋倔；第二雕蔽，對于HPV治療，預(yù)防接種策略奕污；第三萎羔，病毒介導(dǎo)的癌癥耍目。首先民褂，研究表明在HPV陽性HNSCC患者中存在對PD-1定向免疫治療有反應(yīng)的細(xì)胞機(jī)制宝磨。在這些患者的腫瘤中很容易檢測到功能性HPV特異性PD-1+TCF-1+CD8 T細(xì)胞，在抗原刺激后可增殖并分化為效應(yīng)細(xì)胞樣細(xì)胞嘱根。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究HPV陽性頭頸癌PD-1靶向新輔助治療和輔助治療提供了有力的理論基礎(chǔ)。第二巷懈，在為癌癥患者開發(fā)治療性HPV疫苗方面已經(jīng)做出了相當(dāng)大的努力该抒，但這些研究大多集中于HPV E6和E7作為疫苗的靶抗原。本研究表明E2和E5是HPV陽性HNSCC患者腫瘤內(nèi)CD8 T細(xì)胞反應(yīng)的主要靶點(diǎn)顶燕。因此凑保，針對HPV陽性E5作為疫苗抗原的患者的治療性疫苗接種策略可誘導(dǎo)最大范圍的腫瘤反應(yīng)性CD8 T細(xì)胞反應(yīng)。最后涌攻，必須強(qiáng)調(diào)欧引，病毒介導(dǎo)的癌癥是全世界的一個主要公共衛(wèi)生問題。對HPV陽性HNSCC患者CD8 T細(xì)胞反應(yīng)的研究恳谎，可以作為其他病毒介導(dǎo)癌癥免疫反應(yīng)分析的基準(zhǔn)芝此。

教授介紹

Rafi Ahmed教授是美國國家科學(xué)院院士，是世界著名的免疫學(xué)家因痛，長期致力于記憶性T細(xì)胞的分化婚苹，T細(xì)胞及B細(xì)胞的抗病毒免疫機(jī)制的研究。Rafi Ahmed教授研究的長期目標(biāo)是了解B細(xì)胞和T細(xì)胞免疫記憶的機(jī)制鸵膏，并利用這些信息開發(fā)預(yù)防和治療疾病的新疫苗膊升。Rafi Ahmed教授實(shí)驗(yàn)室近期的一項(xiàng)重大突破表明，急性和慢性病毒感染期間谭企，記憶CD8 T細(xì)胞分化存在顯著差異廓译，從而確定抑制性受體PD-1是慢性感染期間T細(xì)胞功能障礙的主要介質(zhì)评肆。這項(xiàng)工作已直接轉(zhuǎn)化為人類臨床研究，其中PD-1抗體阻斷劑已用于治療慢性感染和癌癥秸抚。以通訊作者在Nature, Science, Cell, Nature immunology, Immunity雜志上發(fā)表論文50多篇，是CD8+?T細(xì)胞領(lǐng)域的專家。吭敢。

參考文獻(xiàn)

Eberhardt CS, Kissick HT, Patel MR, et al. Functional HPV-specific PD-1+stem-like CD8 T cells in head and neck cancer. Nature.2021;10.1038/s41586-021-03862-z. doi:10.1038/s41586-021- 03862-z