單端測序和雙端測序
單端測序只有一種測序引物 ，使得PCR只能沿著這個引物的方向進行奕扣，所有的 reads 都只能按照一個方向進行讀取显押。但是測序的質(zhì)量會隨著測序的進行而下降，所以 reads 越往后面越不準(zhǔn)確待诅。一個解決辦法就是雙端測序，對一個長為 500 bp 的序列熊镣，單端測序下游質(zhì)量會很差卑雁，但是從兩個方向上分別測 250 bp-300 bp 然后再拼接起來，就可以大大提高測序的準(zhǔn)確率了绪囱。雙端測序的測序的接頭序列要復(fù)雜一些测蹲，首先為了兩個方向上分別進行測序，就需要有兩個不同方向的測序引物（下圖 Rd1 SP 和 Rd2 SP）鬼吵；其次扣甲，為了區(qū)分兩個方向的 reads，其中一個測序引物前面要添加一小段 index 序列進行標(biāo)記齿椅。
雙端測序中每一個單獨的 Read 其長度都超過整個待測序列的一半琉挖，所以可以根據(jù)兩個 Reads 重合的部分進行拼接
為何要有Paired-end這樣的技術(shù)發(fā)明呢？
①假設(shè)一個DNA片段剛好跨越了重復(fù)序列區(qū)域（下圖左側(cè)）以及獨特序列區(qū)域（下圖右側(cè)）涣脚。假如只讀取Single-Read示辈，我們只會獲得紅色實線的序列信息，也就是ATATATAT遣蚀。接下來顽耳，當(dāng)我們想要將這段read跟reference genome做比對的時候，便會出現(xiàn)問題：到底這段read是出自于紅色實線的位置妙同，還是紅色虛線的位置？這個問題我們就可以使用Paired-end的技術(shù)來加以解決膝迎。由于Paired-end reads之間的距離為已知（在此我們設(shè)為34bp）粥帚，我們便可以先定位綠色read的位置，在正確定位出左邊紅色reads之間AT的位置限次，而不至于將其誤判在紅色虛線的位置芒涡。如下圖所示：
②因為單端測得太長錯誤率會提高，像一代測序也是卖漫，能夠測幾百bp的長度费尽，但是越往后測序出來的條帶雜峰會多，而且不清晰羊始，二代測序也是一樣的道理旱幼，單端測600bp會很不準(zhǔn)確，雙端300bp測序會準(zhǔn)很多突委。
junction
可能序列比較長有四五百bp柏卤，兩邊各測120-150bp冬三，junction就是雙端測序中間沒有測到的區(qū)域。
基因豐富和基因表達的豐度
基因豐度是指基因組中該基因的拷貝數(shù)量缘缚」窗剩基因豐度高，即這個基因的數(shù)量多桥滨，那么可能這個基因的表達量也會多窝爪，但是不一定，主要還是要看該基因的啟動子強弱齐媒。所以基因豐度高不代表表達豐度也高蒲每。
基因表達豐度高是指該基因轉(zhuǎn)錄成mRNA多，那么表達的蛋白也多里初，對于表型的影響就大啃勉。
轉(zhuǎn)錄本
轉(zhuǎn)錄本是由一條基因通過轉(zhuǎn)錄形成的一種或多種可供編碼蛋白質(zhì)的成熟的mRNA，一條基因通過內(nèi)含子的不同剪接可構(gòu)成不同的轉(zhuǎn)錄本双妨。轉(zhuǎn)錄組是由許多轉(zhuǎn)錄本拼接而成淮阐。
RNA與DNA測序之間的差異
測序深度和測序覆蓋度
對長100bp的目標(biāo)區(qū)域進行測序：采用單端測序，每個read長5bp刁品；總共得到了200個reads泣特；把所有的reads比對到目標(biāo)區(qū)域后，100bp的目標(biāo)區(qū)域中有98bp的位置至少有1個read覆蓋到挑随，換言之状您，剩余的2bp沒有1個read覆蓋。
深度：200 x 5 / 100 = 10? ? ? ? ? ? ? ? ? 我們說這此測序的深度為10X兜挨。
覆蓋度：98 / 100 × 100% = 98%? ? ? 我們說這次測序的覆蓋度為98%
測序深度越高膏孟，基因覆蓋度越高。一般人的測序深度到10x拌汇，基因覆蓋度就100%了柒桑，測序深度就飽和了，測序深度再升高沒有什么效果了噪舀。
插入片段大小
通過檢測雙端測序的起止位置魁淳，可以得到插入片段的長度，決定了測序的長度与倡。
引物和接頭
提取基因組DNA后界逛，用超聲波打斷或酶切打斷，然后跑膠得到300-500bp的小片段纺座，因為打斷是隨機打斷的息拜，可能有粘性末端，所以用酶來形成平末端，再在平末端后面加上A堿基得到粘性末端该溯，在加上adapter岛抄，加到flowcell上，進行幾輪的PCR擴增狈茉，就得到了測序文庫夫椭。接頭包括了三部分，依次是與flowcell上結(jié)合的寡聚體氯庆，區(qū)分樣品的index蹭秋，測序需要的引物premer。
在測序時堤撵，首先是測序引物和序列結(jié)合仁讨，然后進行邊合成邊測序（連上一個堿基，測一次实昨，然后進行化學(xué)反應(yīng)洞豁，再連堿基，再測序荒给，這樣循環(huán)下去）丈挟，測夠長度后，將合成的序列去掉志电，然后加上另外一個premer來測index曙咽，這樣每個reads都有一個index（用來識別樣品來源），然后在進行一次橋式PCR擴增挑辆，去掉已經(jīng)測過序的那條鏈例朱，再進行一次測序。
有一點需要注意的是鱼蝉，當(dāng)插入的序列（也就是超聲波打斷的小片段）如果比較短的話洒嗤，或者文庫插入的片段比測序讀長還要短就可能測到premer和index，所以得到數(shù)據(jù)后魁亦，要進行去接頭烁竭。
Index：每個樣品由一個index修飾，得到的reads中也包含了index吉挣，根據(jù)index可以得知雙端測序是否來自于同一個樣品。
鏈特異性建庫
正鏈/負鏈： 對于一個基因來說婉弹，DNA的兩條鏈中有一條鏈作為RNA合成時的模板睬魂，這條鏈叫負鏈（模板鏈/反義鏈），另一條叫正鏈（非模板鏈/正義鏈）镀赌。
反義鏈/正義鏈：在雙鏈DNA中氯哮，用來轉(zhuǎn)錄mRNA的DNA鏈稱為模板鏈，不用于轉(zhuǎn)錄的鏈則稱為非模板鏈商佛。根據(jù)堿基互補配對原則喉钢，轉(zhuǎn)錄出的mRNA鏈的堿基序列與非模板鏈的堿基序列一致姆打，惟一不同的是，非模板鏈中的T在mRNA鏈中全部置換成了U肠虽，因此非模板鏈又被稱為編碼鏈或正義鏈幔戏。
鏈特異性： 鏈特異性建庫，可以確定轉(zhuǎn)錄本來自正鏈還是負鏈税课。以便更加準(zhǔn)確的獲得基因的結(jié)構(gòu)以及基因表達信息闲延。并且可以更好的發(fā)現(xiàn)新的基因。（研究表明：很多基因組區(qū)域具有正負鏈的轉(zhuǎn)錄本韩玩，反義轉(zhuǎn)錄是真核基因的一個特征垒玲，是一種重要的調(diào)控方式。對于原核以及低等真核生物的基因組找颓，常常具有重疊基因合愈。
為何illumina會限制合成的鏈的長度呢，不能像Sanger法一樣击狮，最長測1k佛析？
原因就出在二代測序多出來的PCR過程：每一個位點都要測許多次，比如一段時間后的PCR得到的每個cluster都各包含200條完全相同的序列帘不，那就需要對這200條序列的同一個位點進行測序说莫。
第一輪我們來測第一個位點（假設(shè)位點1是A）正常來講，200條序列都應(yīng)該加A堿基寞焙，但是不巧只有199個在位點1都加了堿基A储狭，有一條序列沒有加上，所以就出現(xiàn)了199個紅色1個灰色【當(dāng)然目前還構(gòu)不成影響】捣郊；
第二輪（假設(shè)位點2是G）大家應(yīng)該都加G測得綠色辽狈，但是之前的那個沒有加上A的，他要對之前的失誤進行補償呛牲，因此別的序列加G的時候刮萌，它加上了本該上次就加的A，它得到了紅色娘扩，這個紅色在一大群的綠色中就是作為雜信號存在的着茸。依次向下，測序長度越長琐旁，雜信號越多涮阔，最后可能標(biāo)準(zhǔn)信號和雜信號各一半，這樣系統(tǒng)無法判斷灰殴，只能給N敬特，而N多了對于后續(xù)的分析處理很麻煩，去了吧丟失數(shù)據(jù)，不去吧又是冗余伟阔。
基因注釋
①RefSeq Gene注釋; 來自于NCBI辣之，對gene的不同轉(zhuǎn)錄本進行注釋，1個轉(zhuǎn)錄本對應(yīng)1個編號成為RefSeq id皱炉，例如對于可以翻譯成蛋白的轉(zhuǎn)錄本怀估，都會以NM_開頭如NM_015658；對于不能翻譯的轉(zhuǎn)錄本娃承，都會以NR_開頭如NR_027055奏夫；不同注釋的情況如下圖(ps:注釋的數(shù)據(jù)庫來源不一樣，編號不一樣)
②Ensembl注釋历筝；對gene的不同轉(zhuǎn)錄本進行注釋酗昼，以ENSG開頭的表示Ensembl gene_id如ENSG00000227232，以ENST開頭的表示Ensembl transcript id如ENST00000438504梳猪。
③UCSC gene注釋麻削；對gene的不同轉(zhuǎn)錄本進行注釋，一般是類似uc004cpf這樣的名稱春弥。
反向互補序列的意義
生物的DNA序列有兩條鏈呛哟，雖然在查看基因組序列的時候網(wǎng)站一般先提供正向鏈，但是不同基因在基因組序列中的轉(zhuǎn)錄起始方向是不同的匿沛，有的基因是正著待著的扫责，有的就是反著待著的。當(dāng)你需要查看轉(zhuǎn)錄方向與正向鏈相反的基因序列時逃呼，你要找到該基因的啟動子（ATG）就需要查看正向鏈的反向互補序列鳖孤。
還有從基因組上擴增序列時需要針對兩條鏈同時設(shè)計引物，此時也需要正向序列及反向互補序列
還有很多很多的基因調(diào)控都是針對兩條鏈同時發(fā)揮作用的抡笼，反向互補序列就是根據(jù)一條鏈的信息推算出另一條鏈的信息苏揣。
基因座
一個基因座可以是一個基因，一個基因的一部分推姻，或具有某種調(diào)控作用的DNA序列平匈。基因座是染色體上的固定部位藏古，在相同基因座上編碼相同的DNA被稱為等位基因增炭。同一基因座上有相同的等位基因就是純合子，相同基因座上是不同的等位基因就是雜合子拧晕。
gene isoforms
亞型/異構(gòu)體隙姿，可以理解為一個基因的不同形態(tài)，就是由同一個基因座產(chǎn)生的mRNA防症，在轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS），編碼蛋白序列，非翻譯區(qū)這些地方有差別蔫敲，間接地改變了基因的功能饲嗽。
圖中1、2奈嘿、3是mRNA的三個外顯子貌虾，由于連接方式不同，產(chǎn)生了三種isoforms裙犹。
可變剪切
大多數(shù)真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA 前體一般按一種方式剪接產(chǎn)生出一種mRNA尽狠，結(jié)果只產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)。但有些基因產(chǎn)生的mRNA 前體可按不同的方式剪接叶圃，產(chǎn)生多于兩種的mRNA袄膏。
編碼蛋白的成熟mRNA是mRNA前體經(jīng)過剪切過的，外顯子可以不按其線性次序剪接掺冠，內(nèi)含子也可以不被切除而保留沉馆。因此成熟的mRNA中每一個外顯子、內(nèi)含子的存在與否都是不一定的德崭。
有5種類型：外顯子跳躍斥黑、內(nèi)含子保留、3眉厨、5‘端可變剪切锌奴、3‘端可變剪切、特定外顯子可變剪切（比如第一個或者最后一個外顯子）憾股。
分析的阻礙
（1）測量標(biāo)準(zhǔn)：為了比較誰多誰少鹿蜀，一般都是采用相對定量的分析方法。但是同樣的絕對數(shù)量對于不同的基數(shù)來講荔燎，得到的相對值也是不同的耻姥。比如，第一次測A有咨、B基因表達量是10琐簇，那么這一次中A基因的豐度就是10/（10+10）=50%；第二次測A座享、B婉商、C表達量都是10，那么這一次渣叛，A的豐度就成了33.3%丈秩，但是能說第二次比第一次A基因的表達量豐度下降了嗎？因此淳衙，只看表面的數(shù)字可能不能反映實際問題蘑秽。
（2）測量方法：目前轉(zhuǎn)錄組測序采用的二代測序饺著，還是測一段DNA的一小部分。由于可變剪切一般將內(nèi)含子去除肠牲，而拼接不同的外顯子幼衰，但畢竟它們“師出同門”，因此得到的轉(zhuǎn)錄本也是相似的缀雳，就像圖中1渡嚣、2組成的轉(zhuǎn)錄本a和1、3組成的轉(zhuǎn)錄本b都含有3肥印，因此要將一小段比對到原始轉(zhuǎn)錄本就比較難（比如识椰，一條reads符合3的一小部分，那么這條reads是屬于轉(zhuǎn)錄本a還是轉(zhuǎn)錄本b呢深碱？）
（3）測量對象：mRNA不像DNA一樣穩(wěn)定腹鹉，它很容易降解，因此它的豐度是時刻改變的莹痢。因此測轉(zhuǎn)錄組之前需要這個時間節(jié)點確保觀察到了變化种蘸，并且這個變化與實驗條件有關(guān)系。一般為了證明這一點竞膳，需要測定一個狀態(tài)下的樣本好幾次航瞭，也就是所做的重復(fù)。差異基因的確定也必須通過重復(fù)來驗證坦辟，也就是一個條件下幾個重復(fù)得到的值如果都與標(biāo)準(zhǔn)條件下幾個重復(fù)的值有差別刊侯，這才認為這個差異基因有效。推薦最少設(shè)置三個重復(fù)锉走，五個更好滨彻。
剪切感知比對
有許多測序reads是來自兩個外顯子的連接處（也就是剪切位點），如果要比對會參考基因組挪蹭，reads的中間肯定會被加入一段空白（也就是原來的內(nèi)含子）亭饵。相當(dāng)于原來reads是腳踏兩條船，現(xiàn)在兩條船要回家梁厉，reads的腿就開始劈叉了辜羊。因此，對比軟件必須要考慮到這一點词顾，容許reads比對回去后八秃，中間含有大大的空隙。
批次效應(yīng)
在不同芯片肉盹、不同測序儀昔驱、不同測序通道或在不同時間點收集的mRNA進行測序，即便是相同的mRNA也會導(dǎo)致測序得到的基因表達量有較大的不同上忍，這就是批次效應(yīng)骤肛。
Short-read短讀長：測序得到的長度最大是500 bp的reads纳本，常見的測序片段長度為100-300 bp。
Long-read長讀長：測序得到的超過1000 bp的reads腋颠，代表全長或近乎全長的mRNA饮醇。
Direct RNA sequencing(dRNA-seq): 直接測序RNA而非cDNA的測序技術(shù)，通常用于測序全長或近全長的mRNA 秕豫。
Multi-mapped reads多重比對的reads：從轉(zhuǎn)錄組同源區(qū)域測序得到的reads，不能精確確認其轉(zhuǎn)錄本或基因組的來源观蓄。
Synthetic long reads合成long reads：通過組裝多個短讀長得到長讀長的方法混移。
唯一分子標(biāo)識符（UMIs）：在擴增前，構(gòu)建RNA-seq文庫的時候加入的短序列或barcodes侮穿，理想情況下每條轉(zhuǎn)錄本結(jié)合一個唯一的標(biāo)識符歌径，含有此標(biāo)識符的reads都來源于此轉(zhuǎn)錄本，定量時只計算一次亲茅』仡酰可以用來降低RNA-seq的定量偏好性，在RNA起始量低的單細胞實驗中尤為適用克锣。
Read length讀長：單個測序reads的長度茵肃，short-read RNA測序得到的長度通常是50-150 bp。
Sensitivity敏感性：樣本中多大比例的轉(zhuǎn)錄本會被測到袭祟，敏感性越高验残，這一比例越高。它受樣本處理巾乳、文庫制備、測序和計算偏好性的影響。
Specificity特異性：度量差異表達轉(zhuǎn)錄本被正確鑒定出的比例的方法佳头，它受樣本處理颜屠，文庫制備，測序和計算偏好性的影響压状。
Duplication rates重復(fù)Reads比率：比對到轉(zhuǎn)錄組相同位置的的測序reads的比例仆抵。在RNA-seq文庫中，一些轉(zhuǎn)錄本可能有高的重復(fù)率何缓，因為它們在樣本中表達水平高肢础。高表達的基因的重復(fù)率很高，而低表達基因的或許有著最小的重復(fù)率碌廓。由此RNA-seq面臨著一個挑戰(zhàn)传轰，該技術(shù)中大部分重復(fù)可能是高表達轉(zhuǎn)錄本帶來的真實信號，而另一些則是由于擴增和測序偏好性造成的谷婆。
生物學(xué)重復(fù)：對生物來源不同的樣本的多次檢測慨蛙，比如來自三個個體的組織辽聊，用于捕獲生物個體自身的變化；這個變化要么是待研究的對象期贫，要么是噪音跟匆。相較之下，技術(shù)重復(fù)是對同樣的樣本做重復(fù)的操作—比如通砍，對一個組織做三次處理玛臂。
Spike-in control內(nèi)參：按特定濃度添加到樣品中的外源核酸庫。它們通常是預(yù)先合成的不同濃度的RNA封孙，用于監(jiān)測反應(yīng)效率和技術(shù)方法的偏差和假陰性結(jié)果迹冤。
Translatome翻譯組：細胞、組織或生物體中正在翻譯成蛋白質(zhì)的mRNA集合虎忌。
Structurome結(jié)構(gòu)組：細胞泡徙、組織或生物體中RNA的二級和三級結(jié)構(gòu)集合。
Interactome互作組：細胞膜蠢、組織和生物體中分子相互作用的集合堪藐，包括有RNA-RNA或者RNA-蛋白質(zhì)的相互作用。
