中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院與山西農(nóng)業(yè)大學(xué)等多個團隊通力合作柜裸，在病毒學(xué)報在線發(fā)表題為B型流感疫苗候選株在MDCK 懸浮細胞上培養(yǎng)工藝優(yōu)化研究终议，通過選株rIBV 在MDCKs細胞上的生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝進行了優(yōu)化土陪，獲得一株具有高感染力和高病毒滴度的MDCKs 細胞源疫苗候選株rIBV巫玻，為下游流感疫苗生產(chǎn)及純化工藝奠定了基礎(chǔ)蔬浙。
季節(jié)性流感是由在世界各地流行的流感病毒引起的急性呼吸道感染性疾病。目前在人類中流行的主要有B型流感病毒等病毒卧晓，預(yù)防接種疫苗仍然是我國當(dāng)今應(yīng)對流感暴發(fā)的有效措施。MDCKs細胞全懸浮培養(yǎng)則不需要添加血清赴捞，相較于雞胚培養(yǎng)逼裆，Vero細胞培養(yǎng)具有更好的穩(wěn)定性和安全性，同時借助艾貝泰生物反應(yīng)器能夠提供大量同步分裂螟炫、增殖快的細胞波附，更能夠保證疫苗質(zhì)量，是當(dāng)前疫苗生產(chǎn)的主流工藝昼钻。
為了大規(guī)模生產(chǎn)重組B型流感疫苗候選株rIBV掸屡，研究探索了rIBV在無血清MDCKs細胞上的最佳培養(yǎng)條件，再擴大到生物反應(yīng)器中優(yōu)化工藝參數(shù)然评，經(jīng)過連續(xù)傳代15代后測定了MDCKs細胞源毒種rIBV的遺傳穩(wěn)定性和病毒滴度仅财。通過對病毒培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，確定了rIBV在MDCKs細胞上增殖的最佳培養(yǎng)條件是TOI為72h碗淌、MOI=0.001盏求、CCI為4.0×10^6細胞、TPCK胰酶濃度為2μg/mL亿眠、50%DO和pH=7.2±0.5碎罚。rIBV在MDCKs細胞上連續(xù)傳代15代后仍然具有高度遺傳穩(wěn)定性。相比于雞胚源rIBV株纳像，適應(yīng)MDCKs細胞生長15代后rIBV株的EID50由106.25/mL提高至109.5/mL荆烈，TCID50由104.5/mL提高至108.25/mL。
MDCKs細胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)
MDCKs細胞經(jīng)搖瓶逐級擴大培養(yǎng)后竟趾，取生長良好的細胞以初始密度為1.5×10^6細胞接種到調(diào)試好的5L生物反應(yīng)器憔购，采用攪拌式培養(yǎng)，有效培養(yǎng)體積為3L岔帽，傳代密度參照搖瓶中優(yōu)化確定的培養(yǎng)條件玫鸟，其他關(guān)鍵參數(shù)：溫度為（37±0.1）℃，pH值7.2±0.3犀勒，DO值50%屎飘，攪拌轉(zhuǎn)速100r/min，連續(xù)培養(yǎng)120h贾费，每12h取細胞培養(yǎng)樣監(jiān)測細胞密度及細胞活率枚碗，做三次重復(fù)；期間每隔24h取樣铸本，按照試劑盒說明書步驟處理樣品，測得葡萄糖遵堵、乳酸和谷氨酸含量箱玷，并進行細胞計數(shù)怨规，每次做三個重復(fù)。
最佳DO的篩選
MDCKs細胞經(jīng)搖瓶逐級擴大培養(yǎng)后锡足，取生長良好的細胞以初始密度為1.5×10^6細胞接種到調(diào)試好的5L生物反應(yīng)器波丰，采用攪拌式，有效培養(yǎng)體積為3L舶得，相關(guān)參數(shù)參照搖瓶中優(yōu)化確定的培養(yǎng)條件掰烟，關(guān)鍵參數(shù)：溫度為（33±0.1）℃，pH值7.2±0.05沐批，DO設(shè)30%纫骑、50%、70%三個對照九孩，攪拌轉(zhuǎn)速120r/min先馆，每24h取細胞培養(yǎng)樣測HA效價，每次做三個重復(fù)躺彬。
MDCKs細胞接種到5L生物反應(yīng)器中煤墙，設(shè)置關(guān)鍵參數(shù)：溫度為（33±0.1）℃，pH值7.2±0.05宪拥，攪拌轉(zhuǎn)速120r/min仿野，確定最佳DO，實50%DO作為后續(xù)反應(yīng)器培養(yǎng)的設(shè)置條件她君。
最佳pH的篩選
MDCKs細胞經(jīng)搖瓶逐級擴大培養(yǎng)后脚作，取生長良好的細胞以初始密度為1.5×10^6細胞接種到調(diào)試好的5L生物反應(yīng)器，采用攪拌式犁河，有效培養(yǎng)體積為3L鳖枕，相關(guān)參數(shù)參照搖瓶中優(yōu)化確定的培養(yǎng)條件，關(guān)鍵參數(shù)：溫度為（33±0.1）℃桨螺，DO值按照優(yōu)化好的值設(shè)定宾符，pH值為6.8、7.0灭翔、7.2魏烫、7.4設(shè)四個對照，死區(qū)設(shè)為0.05肝箱，攪拌轉(zhuǎn)速120r/min哄褒，每24h取細胞培養(yǎng)樣測HA效價，每次做三個重復(fù)煌张。
MDCKs細胞接種到5L生物反應(yīng)器中呐赡，設(shè)置關(guān)鍵參數(shù)：溫度為（33±0.1）℃，DO值50%骏融，攪拌轉(zhuǎn)速120r/min链嘀，確定最佳DO萌狂。我們選擇pH值為7.2為生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件，死區(qū)設(shè)置為0.05怀泊。
結(jié)果
B型重組嵌合病毒rIBV在MDCKs細胞上連續(xù)傳15代后獲得一株高滴度且遺傳穩(wěn)定的MDCKs細胞基質(zhì)疫苗株茫藏。我們對傳代過程中病毒的生長特性及遺傳穩(wěn)定性進行了研究，rIBV按照生物反應(yīng)器優(yōu)化條件霹琼，篩選出一株既遺傳穩(wěn)定又具有高滴度的疫苗株rIBV务傲，病毒滴度的增高也證明了MDCKs細胞其作為疫苗生產(chǎn)基質(zhì)更具有價值。
綜上所述枣申，本研究優(yōu)化了rIBV在MDCKs細胞上的增殖條件售葡，并成功放大到5L生物反應(yīng)器，經(jīng)過連續(xù)傳代獲得一株高感染力和病毒滴度的MDCKs細胞基質(zhì)rIBV疫苗株糯而，為后續(xù)高質(zhì)量疫苗的大批量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)天通。
