單細(xì)胞測(cè)序揭示了骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的潛在發(fā)病機(jī)制

一艾栋、文章基本信息

（1）題目：單細(xì)胞測(cè)序揭示了骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的潛在發(fā)病機(jī)制（2020）
（2）期刊名：Gene
（3）2019年影響因子：2.984
（4）作者單位：溫州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科
（5）摘要：骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種慢性退行性改變，發(fā)病率很高，導(dǎo)致生活質(zhì)量下降和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)增加。 這項(xiàng)研究旨在探討與OA相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因和通路哼凯，這些基因和途徑可用作早期治療的潛在生物標(biāo)記任斋。 從公共數(shù)據(jù)庫（GSE104782和GSE109449）下載了OA中1464個(gè)軟骨細(xì)胞和192個(gè)成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞基因表達(dá)譜，用于后續(xù)分析办龄。 使用Seurat和SingleR軟件對(duì)OA軟骨細(xì)胞和OA成纖維細(xì)胞中的細(xì)胞亞群進(jìn)行了鑒定，共發(fā)現(xiàn)8種軟骨細(xì)胞亞群和3種成纖維細(xì)胞亞群淋昭。此外俐填，鑒定了44個(gè)成纖維樣軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的共同標(biāo)記基因，并且通過功能富集分析進(jìn)一步將粘著斑通路確定為OA的重要潛在機(jī)制翔忽。 此外英融，組織和細(xì)胞水平的逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）實(shí)驗(yàn)證實(shí)，兩個(gè)關(guān)鍵標(biāo)記基因（COL6A3和ACTG1）可能參與了OA的發(fā)展歇式。 綜上所述驶悟，我們推斷OA中的軟骨細(xì)胞可能通過上皮黏附途徑上調(diào)COL6A3和ACTG1的表達(dá)以完成成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。這些發(fā)現(xiàn)有望進(jìn)一步了解OA纖維化過程的發(fā)展材失，并為早期OA的治療提供有希望的目標(biāo)痕鳍。
（6）研究目的：探索OA軟骨細(xì)胞纖維化的過程、關(guān)鍵基因和通路龙巨。
（7）主要發(fā)現(xiàn)：

1. 鑒定了OA中8種軟骨細(xì)胞亞群和3種成纖維細(xì)胞亞群
2. 鑒定了44個(gè)成纖維樣軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的共同標(biāo)記基因
3. Marker基因的功能富集分析指出了粘著斑通路是OA的重要潛在機(jī)制
4. 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）驗(yàn)證了關(guān)鍵標(biāo)記基因（COL6A3和ACTG1）可能參與了OA的發(fā)展
5. 總結(jié)笼呆，OA中的軟骨細(xì)胞可能上調(diào)COL6A3和ACTG1的表達(dá)，通過粘著斑途徑完成成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

二恭应、單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫來源：GEO（GSE104782和GSE109449）

（1）GSE104782

1. 源數(shù)據(jù)發(fā)表的文章：單細(xì)胞RNA-seq分析揭示了人類骨關(guān)節(jié)炎（OA）的進(jìn)展
2. 源數(shù)據(jù)發(fā)表期刊：Ann Rheum Dis 2018 （IF2019: 16.192)
3. 源數(shù)據(jù)情況：10例行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的OA患者的1464個(gè)軟骨細(xì)胞
4. 源文章的主要發(fā)現(xiàn)：
   1）在OA軟骨中鑒定出7個(gè)軟骨細(xì)胞亞群抄邀，包括三個(gè)功能不同的新表型。
   2）發(fā)現(xiàn)在增殖性軟骨細(xì)胞昼榛、增生前軟骨細(xì)胞和肥大軟骨細(xì)胞（HTCs）之間存在一種潛在的轉(zhuǎn)換境肾，并在HTCs中定義了一個(gè)新的亞群。
   3）我們揭示了軟骨祖細(xì)胞（CPCs）的新標(biāo)記物胆屿，并通過計(jì)算分析證明了CPCs和纖維軟骨細(xì)胞之間的關(guān)系奥喻。
   4）得出了與臨床結(jié)果相關(guān)的預(yù)測(cè)指標(biāo)，闡明了不同細(xì)胞類型在OA早期診斷和治療中的作用非迹。

（2）GSE109449

1. 源數(shù)據(jù)發(fā)表的文章：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）中功能不同的疾病相關(guān)成纖維細(xì)胞亞群
2. 源數(shù)據(jù)發(fā)表期刊：Nat Commun 2018 （IF2019: 12.121)
3. 源數(shù)據(jù)情況：上樣細(xì)胞使用蛋白質(zhì)表面標(biāo)記物對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行門控环鲤，數(shù)據(jù)包括來自2名骨關(guān)節(jié)炎患者和2名類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的384個(gè)細(xì)胞。Li et al.的研究采用了其中2名OA患者的192個(gè)滑膜成纖維細(xì)胞細(xì)胞憎兽。
4. 源文章主要發(fā)現(xiàn)：
   1）使用靶向亞群的bulk轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)冷离，揭示人類滑膜組織成纖維細(xì)胞亞群之間的功能和轉(zhuǎn)錄差異吵冒。
   2）確定七個(gè)具有不同表面蛋白表型的成纖維細(xì)胞亞群，通過整合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將其歸納為三個(gè)亞群西剥。
   3）相對(duì)于OA患者痹栖，RA患者的成纖維細(xì)胞亞群的特征是蛋白質(zhì)Podoplanin，THY1膜糖蛋白和cadherin-11的高表達(dá)瞭空，但缺乏CD34揪阿。相對(duì)于OA，RA患者滑膜的成纖維細(xì)胞亞群數(shù)目也成倍增長咆畏。
   4）單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和免疫組化共同顯示南捂，成纖維細(xì)胞位于發(fā)炎的滑膜中的血管周圍區(qū)域，分泌促炎細(xì)胞因子旧找，具有增生作用溺健，并具有浸潤細(xì)胞的體外表型特征。

三钮蛛、分析思路和結(jié)果

1 研究基礎(chǔ)

1）軟骨細(xì)胞是健康軟骨的主要成分矿瘦，產(chǎn)生并維持軟骨基質(zhì)，主要由膠原蛋白和蛋白聚糖組成愿卒。 成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織最常見的細(xì)胞，可合成膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)潮秘。 在OA開始時(shí)琼开，軟骨細(xì)胞的合成代謝能力大大減弱，從而損害軟骨修復(fù)枕荞。 在晚期階段柜候，軟骨細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的纖維軟骨細(xì)胞，產(chǎn)生異常成分躏精，例如纖連蛋白碎片渣刷。 此外，根據(jù)體外研究的最新發(fā)現(xiàn)（Deroyer等人矗烛，2019）辅柴，軟骨細(xì)胞被報(bào)告為調(diào)節(jié)過程增殖和轉(zhuǎn)分化為“軟骨肌成纖維細(xì)胞”。 隨著OA的發(fā)展瞭吃，處于同一病態(tài)組織中的處于不同病理階段的細(xì)胞將會(huì)出現(xiàn)碌嘀，在疾病的發(fā)展中起著獨(dú)特的作用。 因此歪架，通過scRNA-seq分析鑒定不同病理階段細(xì)胞簇的研究工作將有助于更好地了解OA的病因和進(jìn)展股冗。

圖1 設(shè)計(jì)的分析和實(shí)驗(yàn)流程

2 方法與結(jié)果

（1）數(shù)據(jù)獲取和質(zhì)控：

1. 方法步驟
   1)對(duì)OA軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分別進(jìn)行質(zhì)控，分別取每百萬轉(zhuǎn)錄本（TPM）值和log2（TPM值+ 1）值用于后續(xù)分析和蚪；
   2)去除表達(dá)基因在200—7500之外的細(xì)胞止状，表達(dá)量在10以下的細(xì)胞和線粒體基因表達(dá)超過5%的也被去除烹棉。
   3分別對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行PCA降維。
2. 結(jié)果
   OA軟骨細(xì)胞剩余1464個(gè)細(xì)胞怯疤，192個(gè)成纖維細(xì)胞.

(2) 分群和鑒定各軟骨細(xì)胞亞群的標(biāo)記基因：

圖2 分群和鑒定各軟骨細(xì)胞亞群的標(biāo)記基因

1. 方法步驟
   1）使用聚類和T-SNE分析鑒定出細(xì)胞亞群浆洗；
   2）鑒定了每個(gè)亞群的標(biāo)記基因，用每個(gè)亞群的前10個(gè)Marker基因繪制了差異基因表達(dá)熱圖旅薄；
   3）對(duì)每個(gè)亞群進(jìn)行了top2 Marker基因的t-SNE結(jié)果映射可視化辅髓；
   4）進(jìn)行了擬時(shí)序分析；
2. 結(jié)果
   1）通過t-SNE分析少梁，在1,464個(gè)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)不同的簇洛口，通過Marker基因標(biāo)記發(fā)現(xiàn)其中7種為軟骨細(xì)胞，1種為纖維樣軟骨細(xì)胞（圖2A）凯沪；
   2）熱圖顯示8種亞群可以被Marker基因很好的區(qū)分開（圖2B）第焰；
   3）每個(gè)亞群的top2 Marker基因和亞群的分布基本一致(APOD, SDHA, AKR1C2, PRG4, CCL2, S100A2, FOS, HES1, COL10A1, IBSP, KRT17, KRT16, COL1A1, IFI27, SLC5A12, and S100A9)（圖2C）；
   4）擬時(shí)序分析表明軟骨細(xì)胞功能分化出現(xiàn)了4個(gè)分支妨马，成纖維樣軟骨細(xì)胞僅分布在分支3后面的軌跡末端挺举，這暗示了從軟骨細(xì)胞向成纖維細(xì)胞去分化的潛在過程。 （圖2D）

（3）纖維細(xì)胞樣軟骨細(xì)胞亞群中標(biāo)記基因的功能富集分析和蛋白質(zhì)相互作用分析

圖3 基于GO的差異基因富集分析氣泡圖

1. 方法步驟（GO）
   1）（基因本體GO分析）為了進(jìn)一步說明與成纖維樣軟骨細(xì)胞亞群的標(biāo)記基因相關(guān)的生物學(xué)過程（BP）烘跺，使用 g：Profiler在線工具進(jìn)行功能富集分析并可視化不同簇之間的相互作用湘纵。
2. 結(jié)果
   1）標(biāo)記基因在生物學(xué)過程（BP）中顯著富集，包括細(xì)胞外基質(zhì)組織（GO：0010033）滤淳，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織（GO：0001501）梧喷，對(duì)有機(jī)物的響應(yīng)（GO：0071310），骨骼系統(tǒng)發(fā)育 （GO：0070887）脖咐，細(xì)胞對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)（GO：0009888）等铺敌，它們?cè)诩?xì)胞外基質(zhì)中起著至關(guān)重要的作用。 ECM是由膠原蛋白屁擅，酶和糖蛋白組成的細(xì)胞外大分子偿凭，ECM的合成代謝/分解代謝平衡破壞被認(rèn)為是OA發(fā)病機(jī)理的主要事件。
   2）對(duì)于細(xì)胞成分（CC）派歌，發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記基因主要富含細(xì)胞外基質(zhì)（GO：0031012）弯囊，含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)（GO：0062023），細(xì)胞外區(qū)域部分（GO：0044421）硝皂，細(xì)胞外空間（GO：0005615）和細(xì)胞外區(qū)域（GO：0005576）常挚。此外，標(biāo)記基因顯著豐富了細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分（GO：0005201）稽物，結(jié)構(gòu)分子活性（GO：0005198）奄毡，賦予抗張強(qiáng)度的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分（GO：0030020），生長因子結(jié)合（ GO：0019838）和在分子功能組中賦予抗壓性的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分（GO：0030021） 贝或。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織和細(xì)胞外基質(zhì)組織也與軟骨細(xì)胞的生長以及膠原蛋白的重塑密切相關(guān)（Bella and Hulmes吼过，2017）锐秦。
   3）對(duì)于分子功能（MF），Marker基因顯著豐富了細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分（GO：0005201）盗忱，結(jié)構(gòu)分子活性（GO：0005198）酱床，賦予抗張強(qiáng)度的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分（GO：0030020），生長因子結(jié)合（GO：0019838）和具有抗壓性的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分（GO：0030021）趟佃。GO分析表明細(xì)胞成分主要位于細(xì)胞外空間扇谣，細(xì)胞外區(qū)域部分和細(xì)胞外區(qū)域，與ECM的位置一致闲昭。

圖4 KEGG

1. 方法步驟（KEGG）
   1）（KEGG分析）

2. 結(jié)果
   1）KEGG通路分析表明罐寨，在OA的成纖維樣軟骨細(xì)胞亞群中，7種通路表現(xiàn)出明顯的富集序矩，包括局灶黏附鸯绿，ECM受體相互作用，蛋白質(zhì)消化和吸收簸淀，TGF-β信號(hào)通路瓶蝴， 癌癥中的核糖體和蛋白多糖通路（圖4）。功能富集分析（包括BP和KEGG通路分析）表明租幕，標(biāo)記基因與粘著斑通路舷手，ECM-受體相互作用和TGF-β信號(hào)通路密切相關(guān)，表明這些標(biāo)記基因可能參與了 OA中軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞和膠原纖維化的必要性劲绪。
   2）據(jù)報(bào)道聚霜，粘著斑復(fù)合物是細(xì)胞ECM粘附的先決條件，通過細(xì)胞粘附和遷移珠叔，粘著斑激酶（FAK）的活化可能與OA有關(guān)，而關(guān)于粘著斑途徑與粘連的關(guān)系尚缺乏具體的研究弟劲。 OA（Shahrara等祷安，2007； Prasadam等兔乞，2013）汇鞭。

   
   
   圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)
   
   
   圖6 八種軟骨細(xì)胞亞群中7個(gè)候選基因的表達(dá)情況

1.方法步驟（PPI）
1）纖維樣軟骨細(xì)胞亞群中，粘著斑途徑的text-mining（STRING）和PPI網(wǎng)絡(luò)分析（圖5）
差異基因在不同細(xì)胞亞群中的表達(dá)情況（圖6）

2. 結(jié)果
   1）通過text-mining（STRING）庸追，確定了粘著斑途徑是重要的途徑霍骄。
   2）粘著斑途徑的PPI網(wǎng)絡(luò)表明在成纖維樣軟骨細(xì)胞簇中使用相關(guān)的標(biāo)記基因緊密相互作用，其中COL1A1淡溯，COL1A2读整，COMP，CHAD咱娶，COL6A1和COL6A3表現(xiàn)出高度相關(guān)的核心位置米间。
   3）如圖6强品，值得注意的是，在成纖維樣軟骨細(xì)胞簇中屈糊，一些未被報(bào)道的標(biāo)記基因（RHOA、FN1、COL6A1莹汤、CHAD泣棋、CAV1、ACTG1和COL6A3）被鑒定為候選基因昧诱，并且它們也富集在粘著斑途徑中高表達(dá)晓淀，特別是RHOA、COL6A1和COL6A3鳄哭。此外要糊，F(xiàn)N1、CHAD和CAV1在每個(gè)簇之間的表達(dá)水平基本上是無差別的妆丘，表明簇特異性較低锄俄。然而，其他4個(gè)基因的表達(dá)水平存在顯著差異勺拣，COL6A3在成纖維細(xì)胞樣軟骨細(xì)胞群中高表達(dá)奶赠。

（4）候選基因的基因集富集分析（GSEA）

圖7 Marker基因GSEA和RT-qPCR結(jié)果. （A）雙峰分組候選基因得分閾值的雙正態(tài)分布模型。紅線代表低分組候選基因得分分布药有，綠線代表高分組候選基因得分分布毅戈。（B）GSEA顯示了與炎癥相關(guān)的基因集，這些基因集富含具有標(biāo)記基因的樣品愤惰，這些標(biāo)記基因包括IgA產(chǎn)生的免疫網(wǎng)絡(luò)苇经，自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，細(xì)胞粘附分子（CAM）宦言，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用扇单，T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑和造血細(xì)胞譜系；

1. 方法步驟
   1）GSEA基因集富集分析：為了進(jìn)一步研究候選基因在OA機(jī)制中的潛在作用奠旺，根據(jù)候選基因水平將軟骨細(xì)胞分為高亞組和低亞組蜘澜。 我們將候選基因的表達(dá)轉(zhuǎn)化為候選基因分?jǐn)?shù)，并將2.6e-04作為根據(jù)雙正態(tài)分布模型分組的閾值(圖7a)响疚。
2. 結(jié)果
   1）GSEA結(jié)果表明鄙信，候選基因的低表達(dá)并沒有在任何途徑有效富集（p>0.05）。而高表達(dá)的候選基因與炎癥途徑有關(guān)忿晕，例如產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)（標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)（NES）=2.091装诡，F(xiàn)DR=9.96E?04）、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（NES=2.056，F(xiàn)DR=1.36E?03）慎王、細(xì)胞粘附分子（CAMs）（NES=2.115蚓土，F(xiàn)DR=2.05E?03），細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（NES=2.002赖淤，F(xiàn)DR=2.85E?03）蜀漆、T細(xì)胞受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(NES = 1.974, FDR = 4.06E?03)和造血細(xì)胞譜系(NES=2.133，F(xiàn)DR=4.10E?03)咱旱。（圖7b）

（5）OA中每種成纖維細(xì)胞亞群的標(biāo)記基因（第二個(gè)數(shù)據(jù)集）

圖8a-d 共同Marker基因鑒定

圖8e KEGG分析

1. 方法步驟
   1）t-SNE分析
   2）擬時(shí)序分析
   3）維恩圖展示1确丢、2、3號(hào)成纖維細(xì)胞亞群分別與纖維樣軟骨細(xì)胞亞群共同Marker基因鑒定
   4）共同Marker基因的KEGG通路分析
   鑒定纖維樣軟骨細(xì)胞亞群中未被報(bào)道的候選基因與共同Marker基因的共同關(guān)鍵基因
2. 結(jié)果
   1）192個(gè)成纖維細(xì)胞分為3個(gè)不同亞群
   2）擬時(shí)序分析表明2號(hào)成纖維細(xì)胞亞群與其他兩種亞群在發(fā)育上存在較大差別吐限。
   3）共同Marker基因鑒定表明鲜侥，2號(hào)成纖維細(xì)胞亞群和纖維樣軟骨細(xì)胞亞群之間成功鑒定出44種常見標(biāo)記基因，而在其他亞群中幾乎沒有共同的標(biāo)記基因诸典。
   4）KEGG通路分析了2號(hào)成纖維細(xì)胞亞群和纖維樣軟骨細(xì)胞亞群共同的44種常見標(biāo)記基因描函，明顯富集到了膠原沉積相關(guān)的途徑，尤其是在粘著斑粘附和ECM受體相互作用途徑狐粱。
   5）44個(gè)常見標(biāo)記基因與7個(gè)候選基因之間重合的結(jié)果確認(rèn)了四個(gè)未被報(bào)道的關(guān)鍵基因（COL6A1舀寓，COL6A3，ACTG1和RHOA）肌蜻。

（6）通過RT-qPCR驗(yàn)證OA中的關(guān)鍵基因

圖9 與OA組和對(duì)照組相比互墓，COL6A3（a）（e）和ACTG1（c）（f）的相對(duì)表達(dá)差異顯著，而滑膜組織和軟骨細(xì)胞中COL6A1（b）和RHOA（d）則無顯著差異

1. 方法步驟
   1）使用RT-qPCR對(duì)比OA患者和對(duì)照組滑膜組織中的COL6A1蒋搜，COL6A3篡撵，ACTG1和RHOA表達(dá)，選出顯著差別的基因A等
   使用RT-qPCR對(duì)比OA患者和對(duì)照組軟骨組織中A等基因的表達(dá)豆挽，選出顯著差別的基因B等育谬。
2. 結(jié)果
   1）OA滑膜組織中ACTG1和COL6A3的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組滑膜組織，但RHOA帮哈、COL6A1表達(dá)差異不顯著斑司。
   OA軟骨組織中ACTG1和COL6A3的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組軟骨組織，表明ACTG1和COL6A3參與了軟骨組織的纖維化過程但汞。

寫在最后的

此文章是一篇典型的單一表型下不同組織/細(xì)胞大類間的單細(xì)胞測(cè)序分析論文，其分析思路（故事思路）基本如下：
（1）首先互站，在公開數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵詞尋找擬研究細(xì)胞大類（本文是OA軟骨細(xì)胞和OA成纖維細(xì)胞）的單一表型下同一組織/細(xì)胞大類的單細(xì)胞表達(dá)譜類文章私蕾。從而獲得兩種同一表型下兩種或多種組織/細(xì)胞大類的基因-barcodes表達(dá)矩陣。
（2）其次胡桃，兩種數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行質(zhì)控踩叭、降維、聚類、二維嵌入可視化容贝、注釋和差異基因分析自脯、擬時(shí)序分析的基礎(chǔ)分析，目的是根據(jù)先驗(yàn)知識(shí)標(biāo)注細(xì)胞亞群斤富，找到兩種組織/細(xì)胞大類中有明顯分化聯(lián)系的細(xì)胞亞群膏潮，即有很多共同DEGs的，且分別在兩個(gè)擬時(shí)序分析圖像上獨(dú)立（這說明要么處于分化末要么位于分化初满力，可能有分化聯(lián)系）的兩個(gè)亞群（話說能否根據(jù)Marker基因把不同數(shù)據(jù)集的幾個(gè)亞群投射到一個(gè)擬時(shí)序分析圖譜上焕参，應(yīng)該可以）。
（3）接下來油额，對(duì)發(fā)育起點(diǎn)的細(xì)胞亞群（本文中是成纖維樣軟骨細(xì)胞亞群）進(jìn)行差異表達(dá)基因的功能富集分析（GO和KEGG）叠纷，找到富集的生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能（GO）潦嘶，以及富集的通路（KEGG）涩嚣，并根據(jù)先驗(yàn)知識(shí)進(jìn)行解釋，解釋的目的是增強(qiáng)研究目的與找到的擬研究Marker基因之間關(guān)聯(lián)的說服力掂僵，若之前已有人研究過該課題航厚，那么可以嘗試尋找沒有人解釋過的通路。在本文中看峻，作者們重點(diǎn)研究了黏著斑通路阶淘。
（4）在確定了黏著斑通路之后，就可以獲得該通路相關(guān)的DEGs互妓，利用蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）尋找DEGs相互作用情況和核心基因溪窒。粘著斑途徑的PPI網(wǎng)絡(luò)表明，與該通路相關(guān)的成纖維樣軟骨細(xì)胞簇Marker基因呈現(xiàn)緊密相互作用冯勉，其中COL1A1澈蚌，COL1A2，COMP灼狰，CHAD宛瞄，COL6A1和COL6A3表現(xiàn)出高度相關(guān)的核心位置。（這步其實(shí)對(duì)講故事關(guān)系不大交胚，就是做個(gè)圖份汗，關(guān)鍵在下面）
（5）在確定了黏著斑通路之后，就可以獲得該通路相關(guān)的DEGs蝴簇，尋找其中未被報(bào)道過與軟骨組織纖維化有關(guān)的基因作為下一步分析的候選基因杯活，在本文中RHOA、FN1熬词、COL6A1旁钧、CHAD吸重、CAV1、ACTG1和COL6A3被鑒定為候選基因歪今。
（6）分析候選基因在軟骨組織各個(gè)細(xì)胞亞群中的表達(dá)情況嚎幸，將表達(dá)差異明顯的幾個(gè)基因作為重點(diǎn)分析對(duì)象（表達(dá)上調(diào)或下調(diào)都是重點(diǎn)，重點(diǎn)去查他們的文獻(xiàn)寄猩，因?yàn)橛盟麄冎v故事會(huì)比較漂亮）嫉晶，當(dāng)然其他幾個(gè)基因也得查。
（7）接下來做GSEA焦影，分別研究高低表達(dá)的候選基因在各個(gè)通路上的富集情況车遂，這步也是增強(qiáng)結(jié)果的可解釋性。
（8）接下來聯(lián)合分析兩個(gè)數(shù)據(jù)集/組織斯辰，（3）—（7）研究了分化起點(diǎn)的亞群的Marker基因舶担，確定了候選基因。下一步進(jìn)行另一個(gè)數(shù)據(jù)集中承接成纖維樣細(xì)胞亞群的關(guān)聯(lián)細(xì)胞亞群彬呻。在本文中衣陶，是根據(jù)擬時(shí)序分析和差異表達(dá)基因相似性確定的，即2號(hào)成纖維細(xì)胞亞群闸氮。
（9）找到44個(gè)共同的Marker基因后剪况，在做一遍KEGG，又重新確認(rèn)了這些基因富集到的通路和功能的確和纖維化有關(guān)蒲跨。
（10）（3）—（7）中我們找到了7個(gè)候選基因译断，在這里研究者又找了44個(gè)共同基因和7個(gè)候選基因之間的重合基因，一共4個(gè)或悲，作為最后的候選基因做RT-qPCR驗(yàn)證孙咪。（不過我認(rèn)為就算不重合也能解釋的通，因?yàn)槌衫w維細(xì)胞的差異基因不是與軟骨細(xì)胞亞群比較得來的巡语，3個(gè)不重合的基因只是在2號(hào)成纖維細(xì)胞與其他兩種成纖維細(xì)胞比較時(shí)不顯著差異翎蹈，不代表2號(hào)成纖維細(xì)胞中這3個(gè)基因與其他軟骨組織細(xì)胞亞群沒有差異）
（11）采集OA和健康人的臨床樣本，用RT-qPCR驗(yàn)證4個(gè)候選基因是否在OA和健康人中差異表達(dá)男公。結(jié)論是只有2個(gè)基因差異表達(dá)荤堪，那么這兩個(gè)基因就參與了軟骨細(xì)胞的成纖維化。
（不過枢赔，這里還有個(gè)問題澄阳，4個(gè)候選基因是12例OA患者的測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過了各種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出的科學(xué)結(jié)論，這個(gè)結(jié)論的偏差似乎可以用機(jī)器學(xué)習(xí)中的訓(xùn)練集和真實(shí)世界測(cè)試集的分布偏差來解釋踏拜。然而碎赢，RT-qPCR中也只有40例（其中20例OA），這里得到的2個(gè)基因無效执隧，是否需要進(jìn)行進(jìn)一步的證據(jù)合并來得出最終結(jié)論呢？比如meta-analysis？