劉小澤寫(xiě)于19.3.16
看了一篇綜述奕谭，又加了一些擴(kuò)展知識(shí)

文章

這是一篇2017發(fā)表在Genome Medicine上的文章A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications

背景

• 單細(xì)胞測(cè)序：《Nature Methods》2013年度技術(shù)绑嘹；《Nature》2017年7月刊的封面推薦 ；《Science》2018十大科學(xué)突破榜首
• 研究細(xì)胞的方法：基因組DNA序列（堿基如何排列怕吴、各個(gè)序列的豐度）喻奥、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)（常聽(tīng)說(shuō)的3C汉买、4C滋将、5C、HiC等）症昏、mRNA序列（排列與豐度）随闽、非編碼RNA、蛋白表達(dá)肝谭、蛋白修飾掘宪、細(xì)胞代謝【因此不只有scRNA，還有sc基因組攘烛、sc表觀組】
• 一個(gè)細(xì)胞中的待研究分子是微量的魏滚，因此我們一般使用幾千細(xì)胞或直接取組織（上千萬(wàn)甚至上億），這樣就可以積累足夠的分子信息坟漱，可以開(kāi)展 Genome-wide association studies (GWASs) 鼠次、鑒定SNPs
• 主要做什么：分離新細(xì)胞亞群、構(gòu)建細(xì)胞間互作網(wǎng)絡(luò)芋齿、體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)反應(yīng)腥寇、細(xì)胞在不同器官的情況、不同人群比較觅捆、不同物種比較
• 總體≠個(gè)體：細(xì)胞異質(zhì)性的存在（受精卵發(fā)育成個(gè)體赦役，最終去向十分多樣=》肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等等栅炒，why掂摔？术羔；腫塊中心、周?chē)依臁⑥D(zhuǎn)移中的細(xì)胞各異级历，分離出來(lái)判斷療法有效性）
• 挑戰(zhàn)：同時(shí)檢查單個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的數(shù)千種蛋白質(zhì)（蛋白組研究范疇），這個(gè)完整性有待提高

名詞

Barcoding

• 之前做單細(xì)胞簇秒，真的是一個(gè)個(gè)細(xì)胞取出來(lái)鱼喉，然后獨(dú)立構(gòu)建文庫(kù)測(cè)序（比如：流式細(xì)胞術(shù)、激光捕獲顯微切割LCM=》組織切片）趋观，但是這通量非常低（有點(diǎn)Sanger測(cè)序和二代測(cè)序?qū)Ρ鹊母杏X(jué)）扛禽。
• 后來(lái)發(fā)展出高通量的方法，主要是給每個(gè)細(xì)胞加上獨(dú)一無(wú)二的DNA序列（就是條形碼barcode皱坛，就是為了識(shí)別）编曼，然后測(cè)序時(shí)將相同的barcode序列歸為同一個(gè)細(xì)胞來(lái)源
• 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組可以在polyT引物5'端加上barcode；單細(xì)胞基因組目前主要利用高效轉(zhuǎn)座酶（transposase）Tn5實(shí)現(xiàn)

Spike-in

• Spike-ins can be used for assessing the level of technical variability and for identifying genes with a high degree of biological variability

• 每個(gè)細(xì)胞都是獨(dú)特的剩辟，和普通的Bulk RNA-seq不同掐场，材料不容易獲得，不太好做重復(fù)贩猎，因此通過(guò)生物學(xué)重復(fù)來(lái)評(píng)價(jià)技術(shù)手段/數(shù)據(jù)質(zhì)量的方法不靠譜熊户。

• 但是數(shù)據(jù)質(zhì)量還是需要評(píng)價(jià)的，那么就通過(guò)向每個(gè)細(xì)胞裂解液中加入已知序列與一定數(shù)量的合成mRNA吭服，例如 external RNA control consortium (ERCC)【翻譯的話嚷堡，姑且翻譯成：外源RNA對(duì)照聯(lián)盟】開(kāi)發(fā)的“內(nèi)參”，可以根據(jù)RNA讀數(shù)判斷樣本間差異

• 高ERCC含量與低質(zhì)量數(shù)據(jù)相關(guān)

• 但是使用spike-in也有一些問(wèn)題要注意：

  • has to carefully calibrate the concentration that results in an optimal fraction of reads from the spike-ins
  • spike-in mixes are sensitive to degradation
  • captured less efficiently than endogenous transcripts
  • Spike-in不適用于droplet-seq的方法

• UMI( Unique molecular identifier )

  • barcoding的變體艇棕，待擴(kuò)增的RNA分子用隨機(jī)n-mer寡核苷酸標(biāo)記蝌戒。設(shè)計(jì)不同標(biāo)簽的數(shù)量，大大超過(guò)待擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄本沼琉，產(chǎn)生獨(dú)特標(biāo)記的分子北苟，并允許控制擴(kuò)增偏差【例如10-mer的UMI，就會(huì)有 4的十次方 約等于100萬(wàn)種變化】
  • UMI是一段隨機(jī)序列打瘪，每一個(gè)DNA分子都有自己的UMI序列友鼻。可以大大降低PCR誤差（比如：原來(lái)兩個(gè)樣本中某基因表達(dá)量相同闺骚，但是由于兩個(gè)樣本擴(kuò)增效率不同桃移，樣本1為99%，樣本2只有95%葛碧，那么同時(shí)擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)借杰，這同一個(gè)基因就有了0.99^40 / 0.95^40 = 5.2倍差異，因此本來(lái)沒(méi)有差異也會(huì)因?yàn)橥饨缫蛩財(cái)U(kuò)增效率的影響而產(chǎn)生“假陽(yáng)性”）
  • UMI只用在3'轉(zhuǎn)錄本測(cè)序的方法中进泼，如CEL-seq2, Drop-seq, MARS-seq

Dropout

• 基因在一個(gè)細(xì)胞中有表達(dá)蔗衡，但在另一個(gè)細(xì)胞中未檢測(cè)到（按照道理纤虽，每個(gè)基因應(yīng)該都可以檢測(cè)到，只是表達(dá)量多少）
• 可能源于RNA總量少導(dǎo)致擴(kuò)增建庫(kù)丟失 或者 RNA表達(dá)隨機(jī)性

Mass cytometry

• 基于流式細(xì)胞法和質(zhì)譜绞惦，其中使用元素標(biāo)簽標(biāo)記的抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá) - 允許在一次實(shí)驗(yàn)中對(duì)數(shù)千個(gè)單細(xì)胞上的數(shù)十種蛋白質(zhì)進(jìn)行平行測(cè)定

Split-pooling

• (Rosenberg et al. ) combinatorial barcoding to profile single-cell transcriptomes without requiring the physical isolation of each cell

• https://www.rna-seqblog.com/split-seq-single-cell-profiling-with-split-pool-barcoding/

Basic step

• The first, and most important, step in conducting scRNA-seq has been the effective isolation of viable, single cells from the tissue of interest
• Next, isolated individual cells are lysed to allow capture of as many RNA molecules as possible.
• Next, poly[T]-primed mRNA is converted to complementary DNA (cDNA) by a reverse transcriptase.
• Then, amplified and tagged cDNAfrom every cell is pooled and sequenced by NGS.

Types of material

• 理論上逼纸，任何真核生物細(xì)胞都可以
• Primary cells
  • 胚胎 embryo
  • 腫瘤 tumours
  • 神經(jīng) nervous system
  • 造血 haematopoietically derived cells
• The Human Cell Atlas
  • 2017年啟動(dòng)，“媲美人類(lèi)基因組計(jì)劃”济蝉，核心技術(shù)=》單細(xì)胞組學(xué)
  • 對(duì)人類(lèi)37萬(wàn)億個(gè)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞采集杰刽、分類(lèi)和繪圖，側(cè)重描繪組織王滤，而不是整個(gè)器官贺嫂；后期階段可以納入器官及感興趣的疾病小群體
  • 2018.3.8，Sanger研究所宣布人類(lèi)發(fā)育細(xì)胞圖譜（Human Developmental Cell Atlas 雁乡，HDCA）的初步項(xiàng)目25萬(wàn)個(gè)發(fā)育細(xì)胞測(cè)序完成

補(bǔ)充：測(cè)序平臺(tái)

• 10X Genomics
  • 2016.2推出 Chromium第喳；
  • 通量高（7分鐘內(nèi)完成100~80,000個(gè)細(xì)胞的捕獲），周期短踱稍，成本低曲饱，細(xì)胞捕獲效率高（單個(gè)樣本細(xì)胞捕獲率高達(dá)65%）；細(xì)胞活性要求>90% =》 適用于發(fā)現(xiàn)新細(xì)胞
  • 橫向孔道逐個(gè)導(dǎo)入凝膠微珠Gel beads =》 第一個(gè)縱向道輸入細(xì)胞 =》Gel吸附細(xì)胞=》微流控技術(shù)送到第二個(gè)縱向通道（“油tube”）=》油滴GEMs 【因此珠月，一個(gè)油滴就是一個(gè)Gel bead扩淀，也就是一個(gè)細(xì)胞】=》收集到EP管 =》每個(gè)Gel bead表明都放滿了各不相同的Barcode和UMI序列+polyT =》細(xì)胞裂解，polyT抓取mRNA的3'polyA
• BD Rhapsody
  • 分子標(biāo)簽技術(shù)（每個(gè)轉(zhuǎn)錄本標(biāo)記特異性分子標(biāo)簽）=》單細(xì)胞水平上基因表達(dá)譜的絕對(duì)定量
  • 單次實(shí)驗(yàn)可制備100-10000個(gè)單細(xì)胞文庫(kù)
  • CytoSeq特有的蜂窩板技術(shù)（20W+的微孔）啤挎，避免了10X中存在的概率碰撞影響捕獲效率問(wèn)題
  • 可以多樣本混合捕獲驻谆；成像系統(tǒng)；轉(zhuǎn)錄組-蛋白組聯(lián)合分析
• Wafergen公司 ICELL8
  • 基于微流控芯片侵浸，5184個(gè)反應(yīng)孔
  • 每次運(yùn)行可分離500-1000個(gè)細(xì)胞
  • 捕獲效率為30%，成本相對(duì)較低
• Fluidigm公司C1
  • 通量低氛谜、成本高（2000-3000細(xì)胞需要18000-100000美元）掏觉、周期慢
  • 同時(shí)捕獲96個(gè)細(xì)胞
  • 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組
• llumina Bio-Rad
  • ddSEQ
  • 一次性檢測(cè)8個(gè)樣本，每個(gè)樣本可以得到500~10000個(gè)細(xì)胞
  • 組織功能值漫、病情進(jìn)展和治療反應(yīng)方面的協(xié)同作用
  • 捕獲效率低澳腹，僅為3%；成本低
• 1CellBio => InDrop
• Dolomite => μEncapsulator

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