CHIRP(ChromatinIsolation by RNA?Purification)是一種檢測(cè)與RNA綁定的DNA和蛋白相互作用的方法勺爱，可同時(shí)分析lncRNA/circRNA 陪蜻、蛋白及DNA三者互作關(guān)系贵涵。利用ChIRP-seq技術(shù)可用于在全基因范圍內(nèi)定位lncRNA/circRNA的結(jié)合位點(diǎn)和可能結(jié)合的其他RNA分子,是揭示位于細(xì)胞核內(nèi)lncRNA/circRNA 生物學(xué)機(jī)制的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)手段间涵。該方法是通過設(shè)計(jì)與目標(biāo)RNA序列反向互補(bǔ)的生物素探針桩皿，把目標(biāo)RNA拉下來以后香缺，與其共同作用的DNA染色體片段就會(huì)附到鏈霉親和素磁珠上坐漏，最后通過qRT-PCR或測(cè)序來測(cè)定目的RNA愉昆、DNA序列职员，亦或是通過Western或質(zhì)譜分析來測(cè)定蛋白。
圖片來源：
1.Exon-intron circular RNAs regulate transcription? in the nucleus
2.Nucleic Acids Research Advance Access published December 7, 2016
3.Systematic discovery of Xist RNA binding proteins
4.The long non-coding RNA FOXD2-AS1 promotes bladder cancer progression and recurrence through a positive feedback loop with Akt and E2F1
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
（1）跛溉、ChRIP實(shí)驗(yàn)可研究細(xì)胞體內(nèi)互作焊切；
（2）、ChRIP實(shí)驗(yàn)既同時(shí)可研究RNA芳室、蛋白質(zhì)和DNA形成的復(fù)合體之間的互作专肪；也可研究它們之間的兩兩互作；
（3）堪侯、利用ChRIP-MS實(shí)驗(yàn)尋找與目的lncRNA結(jié)合的蛋白嚎尤，可不受lncRNA長(zhǎng)度的限制；
（4）伍宦、利用ChRIP實(shí)驗(yàn)可研究circRNA與蛋白質(zhì)或DNA之間的互作芽死。
技術(shù)流程
（1）、ChRIP-RNA：探針設(shè)計(jì)與合成→細(xì)胞交聯(lián)→細(xì)胞裂解次洼、超聲處理→探針雜交→復(fù)合物純化→RNA回收與純化→NGS或qRT-PCR檢測(cè)关贵；
（2）、ChRIP-DNA：探針設(shè)計(jì)與合成→細(xì)胞交聯(lián)→細(xì)胞裂解卖毁、超聲處理→探針雜交→復(fù)合物純化→DNA回收與純化→NGS或qPCR檢測(cè)揖曾；
（3）、ChRIP-Protein：探針設(shè)計(jì)與合成→細(xì)胞交聯(lián)→細(xì)胞裂解、超聲處理→探針雜交→復(fù)合物純化→蛋白分離→質(zhì)譜鑒定翩肌。
ChIRP實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)分組如下：
（1）模暗、IP組：目標(biāo)lncRNA/circRNA Odd組和Even組（即實(shí)驗(yàn)組，用于鑒定lncRNA/circRNA作用基因組位置）
（2）念祭、lacZ組：外參對(duì)照組兑宇，證明ChIRP探針的特異性；
（3）粱坤、Input組：捕獲前分離提取的基因組DNA隶糕，作為內(nèi)參對(duì)照組，證明探針特異性站玄；
（4）枚驻、Positive組：陽性對(duì)照組，通過已知驗(yàn)證有效的探針株旷，通過WB檢測(cè)已知結(jié)合蛋白質(zhì)再登，證明整個(gè)ChIRP實(shí)驗(yàn)體系的有效性；
（5）晾剖、目標(biāo)lncRNA/circRNAqPCR：證明ChIRP探針對(duì)目標(biāo)lncRNA的正確結(jié)合及有效捕獲锉矢。
案例分析
案列1：ChRIP-protein研究
結(jié)果解析：圖A展示的整個(gè)ChIRP-WB或ChIRP-MS實(shí)驗(yàn)大致的實(shí)驗(yàn)流程；圖B闡述的是ChIRP實(shí)驗(yàn)中U1探針和U2探針富集到的RNA長(zhǎng)度分布齿尽，結(jié)果顯示沽损，input組的RNA大小為150-4000nt不等，而U1探針和U2探針富集的RNA長(zhǎng)度為150-200nt循头，說明U1探針和U2探針能有效地富集樣本中的U1和U2绵估；圖C是U1、U2卡骂、U3的ChIRP-WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果国裳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，U1和U2可與U1A蛋白結(jié)合偿警，U3可與FIBRILLARIN蛋白結(jié)合躏救。
參考文獻(xiàn)：Systematic discovery of Xist RNAbinding proteins唯笙，figuer1.
案列2：ChRIP-DNA研究
結(jié)果解析：圖A展示的是通過生物信息學(xué)分析螟蒸，預(yù)測(cè)出lncRNA FOXD2-AS1與TRIB3 Promoter的三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；圖B是lncRNA FOXD2-AS1在UM-UC-3細(xì)胞中進(jìn)行ChIRP-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果崩掘；圖C是ChIRP實(shí)驗(yàn)中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1的奇數(shù)探針和偶素探針的富集效率檢測(cè)結(jié)果七嫌。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，lncRNA FOXD2-AS1可與TRIB3 Promoter結(jié)合苞慢，且結(jié)合位點(diǎn)位于預(yù)測(cè)位點(diǎn)的P3位點(diǎn)诵原。
參考文獻(xiàn)：The long non-codingRNA FOXD2-AS1 promotes bladder cancer progression and recurrence through apositive feedback loop with Akt and E2F1，figuer6.
案列3：ChRIP-circRNA-protein研究
結(jié)果解析：圖a展示的是圖b、c绍赛、d實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)流程圖蔓纠；圖b是利用circRNA探針進(jìn)行的類似ChIRP實(shí)驗(yàn)原理的RNApulldown結(jié)果；圖c是對(duì)圖a的circRNA-RNA pulldown產(chǎn)物進(jìn)行qPCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吗蚌；圖d是利用circRNA探針進(jìn)行ChIRP-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果腿倚。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，circEIF3J和circPAIP2能與RNA聚合酶復(fù)合體結(jié)合蚯妇，也能與本身目基因啟動(dòng)子結(jié)合從而調(diào)控母基因的表達(dá)水平敷燎。
參考文獻(xiàn)：Exon-intron circular RNAsregulate transcription in the nucleus，figuer5.
案列4：ChRIP-circRNA-miR研究
結(jié)果解析：圖A展示的是circPVT1與microRNA結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果箩言；圖B是類似ChIRP實(shí)驗(yàn)原理的circRNApulldown原理圖硬贯；圖C是對(duì)circRNA-RNA pulldown產(chǎn)物進(jìn)行circPVT1的qPCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該結(jié)果反映的是circPVT1探針的有效性陨收；圖D是circRNA-RNA pulldown產(chǎn)物進(jìn)行microRNA qPCR檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果饭豹。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，circPVT1能與has-let-7有效結(jié)合务漩，從而達(dá)到富集細(xì)胞內(nèi)的游離的has-let-7墨状，進(jìn)而間接調(diào)控has-let-7的下游靶基因。
參考文獻(xiàn)：Identification of senescence-associatedcircular RNAs(SAC-RNAs) reveals senescence suppressor CircPVT1菲饼，figuer4.
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樣本要求：
細(xì)胞數(shù)量：細(xì)胞數(shù)量需要達(dá)到108個(gè)肾砂；提供活細(xì)胞樣本。
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實(shí)驗(yàn)周期：
50個(gè)工作日宏悦。
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其他注意事項(xiàng)：
1镐确、目標(biāo)lncRNA/circRNA的表達(dá)豐度：
2、如果目標(biāo)lncRNA/circRNA表達(dá)豐度較低饼煞，需要進(jìn)行過表達(dá)以確保ChIRP成功源葫；
