1 原理
詳細(xì)信息參見2013年的QTL-seq 文獻(xiàn)具篇，這里只做簡單介紹。
1.1 群體構(gòu)建
QTL-seq 將 BSA（bulked-segregant analysis）及全基因組測序進(jìn)行結(jié)合，識別與目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的 QTLs。要達(dá)到這一目的颅悉，我們首先需要構(gòu)建一個包含極端目標(biāo)表型的定位群體帆调。根據(jù)性狀的不同奠骄，可以采取不同的群體構(gòu)建方法：
重組自交系（recombinant inbred lines, RILs）和同質(zhì)雙單倍體（doubled haploids, DH）具有較高的純合性，每個 line 中的個體都具有表型的可重復(fù)性番刊，可用于檢測具有較小效應(yīng)的 QTLs含鳞。
兩個品系 A 和 B 雜交后自交所得的F2群體也可以用于進(jìn)行 QTL-seq 分析，優(yōu)點是獲得群體所需時間短撵枢，但是由于基因型的不可重復(fù)性民晒，因此適合于檢測效應(yīng)較大的 QTLs。
1.2 測序分析
如圖a所示锄禽，我們擬分析與水稻株高相關(guān)的 QTL潜必。如果有多個 QTL 影響株高，不同株高的頻數(shù)分布圖將近似于正態(tài)分布沃但。將具有極端表型的個體組成兩個極端群（highest bulk及l(fā)owest bulk）磁滚，每個極端群中的個體均取等量 DNA 組成混池 DNA，對混池的 DNA 樣品進(jìn)行全基因組重測序宵晚，以識別在其中起主要作用的 QTL垂攘。與此同時，我們還需對其中一個親本群體進(jìn)行測序淤刃，以獲得參考親本基因組的信息晒他。
由于兩個極端群體只在“株高”這一個表型上有差異，理論上逸贾，我們可以認(rèn)為基因組上的絕大區(qū)域陨仅，在兩個群體之間并沒有區(qū)別，均等量來源于兩個親本基因組铝侵。而只有與“株高”相關(guān)的 QTL 所在區(qū)域在兩個極端群中存在區(qū)別灼伤。我們的任務(wù)，就是把這些區(qū)域找出來咪鲜。
1.3 SNP-index
在這里狐赡，引入一個指標(biāo) SNP-index 來表示子代群體與親本之間的序列差異程度。SNP-index 指的是在特定位點上疟丙，攜帶有不同于參考親本的 SNP 的 reads 數(shù)占比對到同一位點的所有 reads 總數(shù)的比值（圖b）颖侄。
SNP-index 為0，說明比對到這一位點的所有 reads 都來源于參考親本隆敢；SNP-index 為1发皿，說明這些 reads 都來源于非參考親本；而 SNP-index 為0.5說明這一位點的信息等量來源于兩個親本拂蝎。如果某一 SNP 在兩個極端群中的 SNP-index 均小于0.3，可認(rèn)為這樣的SNPs是由于測序或比對錯誤所致惶室，建議舍棄温自。
1.4 Delta(SNP-index)
將兩個極端群的 SNP-index 相減玄货，所得的 Delta(SNP-index) 可以更直觀地顯示兩個極端群在基因組上的差異情況。Delta(SNP-index) 為1或-1說明相對應(yīng)的 SNP 來源于其中一個親本悼泌，這一位點及其周邊很有可能是參與株高性狀形成的區(qū)域松捉。
2 QTL-seq 分析流程
操作系統(tǒng)：Red Hat Enterprise Linux 7
QTL-seq 的分析流程可以從開發(fā)者的網(wǎng)站直接下載，參照其中的說明文檔進(jìn)行操作馆里。
作者的說明文檔講述比較清晰隘世，這里只補(bǔ)充幾點需要特別注意的點：
2.1 所需軟件
| 開發(fā)者建議的版本 | 實際分析時使用的版本或說明 |
|---|---|
| Perl (v5.8.8) | Perl v5.26.2 |
| Perl module Math::Random::MT::Auto 6.14 | 安裝失敗。后將ibrc_scripts/1./reduce_read.pl 中的 "use Math::Random::MT::Auto 'rand';" 設(shè)為注釋鸠踪，直接使用 Perl 自帶的 rand() 函數(shù) |
| R (version 2.15.0) | R v3.4.1 |
| BWA (version 0.5.9-r16) | BWA v0.7.16a-r1181 |
| SAMtools (0.1.8 or before) | 建議使用 SAMtools v 0.1.8丙者，因為新版本中部分命令有變動，流程中的代碼修改起來比較麻煩 |
| FASTX-Toolkit | fastx_toolkit v0.0.14 |
2.2 主要操作流程（按照說明文檔進(jìn)行即可）
2.2.0 設(shè)置配置文件（參考說明文檔营密，根據(jù)實際情況進(jìn)行修改）
注意：如果 reads 為phred 33械媒，在config.txt 文件中進(jìn)行設(shè)置：
Key1_Score_type_for_my_cultivar="sanger"
