劉小澤整理于2019.4.19+4.26
有幸參加了4.19的上海交大單細(xì)胞論壇蹄咖，下面簡(jiǎn)單記錄了一下會(huì)議內(nèi)容

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)探索人類胚胎發(fā)育-湯富酬教授

簡(jiǎn)介：湯老師課題組主要圍繞人類早期胚胎發(fā)育箱亿、多能干細(xì)胞的自我更新能力和多能性調(diào)控的分子機(jī)理，特別是表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)理捡鱼，以及相關(guān)的原始生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的表觀遺傳學(xué)重編程機(jī)理瘾腰。利用單細(xì)胞功能基因組學(xué)分析技術(shù)(單細(xì)胞RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組分析理郑、單細(xì)胞DNA甲基化組測(cè)序技術(shù)、單細(xì)胞多組學(xué)平行測(cè)序技術(shù)等)屎暇，以及基因編輯技術(shù)、少量細(xì)胞染色體免疫共沉淀-高通量測(cè)序技術(shù)驻粟、單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)根悼、小鼠胚胎顯微操作技術(shù)和胚胎干細(xì)胞體外定向分化等技術(shù)在單細(xì)胞和單堿基分辨率深入分析人類早期胚胎、生殖系細(xì)胞蜀撑、以及多能干細(xì)胞中基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)理

主要做人類著床前胚胎挤巡，困難在于胚胎數(shù)量比較少，通常一個(gè)大型個(gè)體只有十幾個(gè)至幾十個(gè)胚胎酷麦，每個(gè)胚胎只有一個(gè)或者少量的細(xì)胞矿卑，后來(lái)到囊胚之后，又會(huì)有幾種不同類型的細(xì)胞贴铜，因此需要單細(xì)胞分辨率的方法去檢測(cè)基因表達(dá)粪摘；

另外還需要全基因組水平的單細(xì)胞檢測(cè)方法，人體細(xì)胞中有2萬(wàn)多個(gè)基因绍坝，如果在受精卵里面去看這些基因的表達(dá)徘意，需要一個(gè)一個(gè)去做，那么就需要幾萬(wàn)個(gè)細(xì)胞轩褐，另外這樣沒(méi)有辦法看到基因與基因之間的正負(fù)相關(guān)關(guān)系椎咧。如果能拿一個(gè)細(xì)胞就檢測(cè)出所有的基因，不僅可以節(jié)省使用材料把介，而且還可以探究任何兩個(gè)基因之間正向或者負(fù)向相關(guān)勤讽。

目前單細(xì)胞技術(shù)已經(jīng)被用在幾百個(gè)課題中，來(lái)檢測(cè)細(xì)胞異質(zhì)性拗踢、細(xì)胞類型脚牍、細(xì)胞發(fā)育階段、每種階段中基因表達(dá)情況等等巢墅。

2009年在英國(guó)博后期間首創(chuàng)單細(xì)胞技術(shù)诸狭；

2013在北大組建團(tuán)隊(duì)，關(guān)注基因表達(dá)調(diào)控(DNA甲基化如何影響胚胎早期發(fā)育)君纫，開(kāi)發(fā)了世界第一個(gè)單細(xì)胞DNA甲基化測(cè)序技術(shù)驯遇，使用人或小鼠的一個(gè)細(xì)胞，就可以檢測(cè)100萬(wàn)個(gè)以上CpG甲基化位點(diǎn)蓄髓。

當(dāng)時(shí)遇到的困難：審稿人要求數(shù)據(jù)驗(yàn)證叉庐，但是當(dāng)時(shí)沒(méi)有這樣一種單細(xì)胞DNA甲基化測(cè)序方法，而且沒(méi)有單細(xì)胞CpG位點(diǎn)的檢測(cè)方法会喝。因此又開(kāi)發(fā)了單個(gè)細(xì)胞中單個(gè)CpG位點(diǎn)的檢測(cè)方法陡叠，然后研究了人類生殖細(xì)胞的DNA甲基化組是如何變化的玩郊。

知道了精子和卵細(xì)胞的基因組都是高甲基化的，發(fā)育第一個(gè)星期匾竿，大約有一半的CpG位點(diǎn)被擦掉瓦宜，到了囊胚期多能性內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞階段，大概只有43%甲基化位點(diǎn)留下岭妖；之后在胚胎發(fā)育的第二個(gè)星期临庇，進(jìn)行胚胎著床(粘到子宮壁上)，這個(gè)過(guò)程中甲基化會(huì)重新增加昵慌，結(jié)果比在精子和卵細(xì)胞中還要高一些假夺，甲基化中位數(shù)在91%左右；著床后胚胎的所有體細(xì)胞也是存在hypermethylation（甲基化）狀態(tài)的斋攀，而原始生殖細(xì)胞中甲基化是要重新擦掉(擦掉上一代所有的甲基化已卷，讓下一代根據(jù)基因組序列去重構(gòu)表觀信息)；胚胎發(fā)育到10-11周時(shí)淳蔼，基因組中絕大多數(shù)甲基化都被擦掉侧蘸，甲基化中位數(shù)大約只有7%左右，但是這僅僅是總體平均水平鹉梨，實(shí)際上與轉(zhuǎn)座相關(guān)的重復(fù)序列還有很多的甲基化留下來(lái)讳癌。一方面，當(dāng)代想要盡可能去除上一代的"表觀記憶"存皂，另一方面晌坤，又不想讓重復(fù)序列發(fā)生大量轉(zhuǎn)錄，造成大量轉(zhuǎn)座影響旦袋，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定骤菠。這里胚胎就選擇了一個(gè)平衡：沒(méi)有轉(zhuǎn)座風(fēng)險(xiǎn)的地方就盡可能擦除甲基化，有轉(zhuǎn)座風(fēng)險(xiǎn)的地方就保留了一些甲基化疤孕，將上一代的一些表觀記憶帶到了下一代

同時(shí)商乎，由于當(dāng)時(shí)技術(shù)限制，沒(méi)有再深入探索祭阀。于是提出問(wèn)題：精子甲基化比卵細(xì)胞要高很多（16%左右）截亦，那么精卵結(jié)合后甲基化比例怎么變化？是二者相等柬讨，還是繼續(xù)保持精>卵，又或者是發(fā)生了逆轉(zhuǎn)卵>精袍啡？

為了回答上面沒(méi)有論證的問(wèn)題踩官，又利用父母源基因組測(cè)序+單個(gè)細(xì)胞中雜合SNP信息的獲取，就可以分開(kāi)一個(gè)細(xì)胞中的父源基因組和母源基因組境输，這樣可以做到半個(gè)單細(xì)胞的甲基化測(cè)序 (2018蔗牡，Parental specific DNA methylation dynamics duiring human)颖系，結(jié)果就發(fā)現(xiàn)，父源基因組去甲基化速度非潮缭剑快嘁扼，發(fā)生一次卵裂后父源基因組甲基化就比母源少8-10倍，也就是甲基化發(fā)生了強(qiáng)烈的逆轉(zhuǎn)黔攒，雖然這個(gè)差異是在著床前7天產(chǎn)生的差異趁啸，但是著床后雖然差異沒(méi)有那么大，但仍然父源會(huì)比母源基因組低2-3倍督惰，也就是說(shuō)不傅，雖然父源開(kāi)始想要把更多的甲基化信息傳遞到后代胚胎中去，但是因?yàn)橹埠笤缙谂咛グl(fā)育主要是依靠母源基因組赏胚，所以會(huì)把絕大多數(shù)父源甲基化信息擦掉访娶。

表觀遺傳學(xué)中除了甲基化以外，染色質(zhì)狀態(tài)也很重要觉阅，實(shí)驗(yàn)室也開(kāi)發(fā)了單細(xì)胞多組學(xué)的方法崖疤，可以看到DNA甲基化、染色質(zhì)狀態(tài)典勇、基因組拷貝數(shù)變異劫哼。大體方法就是：?jiǎn)渭?xì)胞輕微裂解，保持細(xì)胞活性和染色質(zhì)狀態(tài)=》體外甲基化處理（甲基化酶作用到GpC位點(diǎn)的胞嘧啶）=》哺乳動(dòng)物內(nèi)源甲基化在CpG位點(diǎn)痴柔，這個(gè)C位點(diǎn)與GpC的絕大部分是分開(kāi)的沦偎，如果測(cè)到一個(gè)DNA序列是open chromatin狀態(tài)，也就是裸露的DNA雙鏈咳蔚，上面的GpC位點(diǎn)會(huì)被甲基化豪嚎；如果是核小體占位或者異染色體區(qū)域，那么GpC位點(diǎn)不會(huì)甲基化。

染色質(zhì)狀態(tài)研究應(yīng)用：
人早期胚胎只有60-80%可以正常發(fā)育的整倍體細(xì)胞瞳筏，還有一些是多/少一兩條=》可以根據(jù)單細(xì)胞的拷貝數(shù)變異贪庙，分開(kāi)胚胎中整倍體細(xì)胞和異常的非整倍體細(xì)胞=》實(shí)驗(yàn)做了280多個(gè)單細(xì)胞的基因組分析，發(fā)現(xiàn)有60多個(gè)是非整倍體細(xì)胞=》
主要研究整倍體細(xì)胞=》
另外扔字，研究了小鼠模型表觀基因組變化，發(fā)現(xiàn)與人差異較大温技，比如基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)揮作用是在小鼠1細(xì)胞到2細(xì)胞階段革为，在人胚胎中是4細(xì)胞到8細(xì)胞階段=》
最開(kāi)始時(shí)卵的染色質(zhì)很開(kāi)放，精子的很致密舵鳞；受精以后發(fā)生逆轉(zhuǎn)震檩；8細(xì)胞后重新回落，父源與母源在每個(gè)單細(xì)胞中的開(kāi)放程度是一樣的，這個(gè)現(xiàn)象是人類特有的=》小鼠模型還是存在局限性抛虏，還是直接研究人的胚胎更準(zhǔn)確=》
生殖細(xì)胞發(fā)育不止在胚胎發(fā)育中存在博其，在出生后也是一直存在的，特別是精子發(fā)生過(guò)程迂猴，出生后還需要經(jīng)歷一些復(fù)雜的階段慕淡，最后才能變成成熟的長(zhǎng)尾巴的精子，但是這個(gè)過(guò)程研究復(fù)雜沸毁，因此利用了同步化小鼠胚胎發(fā)育到20個(gè)重要發(fā)育階段中=》
在每個(gè)重要階段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析峰髓，找到重要的marker表達(dá)特點(diǎn)=》
每個(gè)發(fā)育階段大約需要3~4個(gè)marker，并且沒(méi)有跳躍連續(xù)發(fā)育過(guò)程以清，可以找到中間態(tài)=》
如果有的基因很早期就上調(diào)表達(dá)儿普，那么很有可能就是一個(gè)master regulator gene；如果在比較晚才上調(diào)表達(dá)掷倔，那么有可能是一個(gè)下游執(zhí)行基因

發(fā)現(xiàn)原型精子早期和晚期發(fā)育差異特別巨大眉孩，比其他任何兩個(gè)相鄰發(fā)育階段的差異都大。
提出一個(gè)現(xiàn)象：男性不育沒(méi)有長(zhǎng)尾巴的精子勒葱，但有原型精子浪汪，因此醫(yī)院有時(shí)會(huì)利用原型精子做試管嬰兒，但結(jié)果仍然比有尾精子效率低很多凛虽。

猜測(cè)：不是原型精子本身不適合做試管嬰兒死遭，而是由于原型精子早期和晚期之間差別很大，晚期效果要好于早期階段的精子

功能試驗(yàn)（利用小鼠）：將原型精子分為早期和晚期階段凯旋，分別注射到小鼠成熟的卵細(xì)胞中呀潭，發(fā)現(xiàn)晚期的原型精子可以支持胚胎發(fā)育成囊胚并且效率較高，但早期不行=》目前正在嘗試人類胚胎至非，找到精子發(fā)生上下游級(jí)聯(lián)關(guān)系钠署，成功的話可以提取晚期精子，提高體外胚胎成功率

探索人類精子發(fā)生過(guò)程：正常男性精子發(fā)生圖譜：睪丸中隨機(jī)挑選2000多個(gè)單細(xì)胞荒椭，進(jìn)行scRNA分析谐鼎，找到從精原干細(xì)胞到原型精子的整個(gè)發(fā)育階段以及每個(gè)階段重要marker基因表達(dá)的變化；更關(guān)心的是趣惠，男性不育患者精巢單細(xì)胞（患者的精巢中已經(jīng)不存在生殖細(xì)胞狸棍，但是生殖細(xì)胞的微環(huán)境還在），利用單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)了精巢中一個(gè)重要的體細(xì)胞--Sertoli Cell味悄，與正常人相比發(fā)生了很大的基因表達(dá)變化草戈，因此不僅生殖細(xì)胞沒(méi)有，而且體細(xì)胞也發(fā)生了DNA損傷侍瑟，因此不能進(jìn)行正常的精子形成

除了生殖細(xì)胞猾瘸，還做了腦細(xì)胞發(fā)育圖譜、一整個(gè)系統(tǒng)的細(xì)胞圖譜，比如消化道(食道牵触、胃、小腸咐低、大腸)整個(gè)的發(fā)育過(guò)程

總結(jié)：

目前細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)：

• 以基因?yàn)楹诵睦克迹龈鞣N調(diào)控關(guān)系，最后都要落到具體的基因上
• 聚焦基因的直接互作见擦，連接它們之間的分子關(guān)系
• 上下游因果钉汗，比如想看到A基因促進(jìn)B基因的上調(diào)

未來(lái)可能新增：

• 不局限與單個(gè)基因=》基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
• DNA系統(tǒng)冗余性vs魯棒性【既然一個(gè)鏈就包含了遺傳信息，為何雙鏈鲤屡？二倍體（一對(duì)等位基因）损痰？很多內(nèi)臟器官成對(duì)分布（兩個(gè)腎、兩半肺）=》猜測(cè)：分子通路是否也是冗余的（同一個(gè)功能至少有兩個(gè)以上的平行分子來(lái)實(shí)現(xiàn)）酒来？】
• human cells in vitro人類體細(xì)胞直接研究(不用退到動(dòng)物模型上)
• 系統(tǒng)預(yù)測(cè)：看到什么變化卢未，哪些可能與疾病有關(guān)，早期發(fā)現(xiàn)疾病

提問(wèn)：

• Q1：每個(gè)階段可以找到3~5個(gè)高表達(dá)的基因(marker)堰汉，但它們是否是發(fā)育的關(guān)鍵基因辽社？

  A1：找到的marker確實(shí)有一些是下游的沒(méi)那么重要的基因

• Q2：找到了高表達(dá)基因，那么有沒(méi)有一些基因被特異地關(guān)閉翘鸭，那么這些關(guān)閉的基因是否為關(guān)鍵基因滴铅？

  A2：比如從A階段到B的兩個(gè)狀態(tài)的細(xì)胞，A階段的marker必須很早就要關(guān)閉就乓，這樣才能允許B階段發(fā)育汉匙；如果是相對(duì)較晚的關(guān)閉就會(huì)次要一些。因此通過(guò)A生蚁、B中間態(tài)尋找噩翠，不僅可以找到B階段的marker，還可以找到A階段的marker

• Q3：開(kāi)發(fā)的scCOOL-seq與ATAC-seq的比較守伸？

  A3：主要區(qū)別就是：ATAC-seq直接看的就是open chromatin區(qū)域(只占基因組不到1%)绎秒，異染色體就沒(méi)有觀察；scCOOL-seq就是首先擴(kuò)增基因組片段(不管是open還是異染色體區(qū)域)尼摹，這樣open和closed都可以看到见芹，但是缺點(diǎn)就是closed比open多一百倍，這樣需要測(cè)序深度很深蠢涝，通量有限玄呛；如果想得到單細(xì)胞信息的話，使用ATAC-seq又快又便宜和二；如果想在少量細(xì)胞中看的更全的話徘铝，scCOOL-seq可以看的更清楚

• Q4：利用marker gene表征各個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，怎么確定一個(gè)cell type中的marker就是穩(wěn)定表征的？

  A4：找的marker在每個(gè)細(xì)胞中都是表達(dá)的惕它，但是大部分marker在每個(gè)細(xì)胞都會(huì)有波動(dòng)怕午，原因有兩個(gè)：內(nèi)源生物學(xué)+技術(shù)誤差。這里提出的："中間態(tài)" 概念就很好淹魄，原來(lái)都關(guān)注不同的cell type郁惜，把不同類型看成分離的。但從發(fā)育角度看甲锡，它們都來(lái)自一個(gè)受精卵兆蕉，所以所有的的細(xì)胞類型都是連續(xù)的，由于技術(shù)因素或者關(guān)注點(diǎn)不同缤沦，忽略掉了中間的過(guò)程』⒃希現(xiàn)在技術(shù)可以看到中間態(tài)了，那么細(xì)胞類型這個(gè)定義就存在一些問(wèn)題缸废，比如從A到B發(fā)育階段中間的細(xì)胞包蓝，算A階段細(xì)胞還是算B的？或者一種細(xì)胞分化成兩種細(xì)胞呆奕，到什么時(shí)間算是徹底分開(kāi)养晋？

• 單細(xì)胞未來(lái)技術(shù)：造價(jià)、靈敏度梁钾、通量（目前一個(gè)細(xì)胞10元）+擴(kuò)展單細(xì)胞組學(xué)(現(xiàn)在出了sc-chipseq)+單細(xì)胞代謝組绳泉、蛋白組

小鼠胚胎空間轉(zhuǎn)錄組圖譜-景乃禾教授

主要從事中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分子機(jī)制和多能干細(xì)胞神經(jīng)定向誘導(dǎo)分化的調(diào)控機(jī)制研究

主要做小鼠著床后胚胎

受精后在輸卵管=》4.5天著床，向下長(zhǎng)形成長(zhǎng)形結(jié)構(gòu)姆泻，近端與遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)=》5.5天后端原條結(jié)構(gòu)出現(xiàn)=》6.5-7.5天進(jìn)行原腸運(yùn)動(dòng)零酪，24h分出來(lái)3個(gè)胚層：外胚層（又繁分化為表皮、神經(jīng)系統(tǒng)）拇勃、中胚層（骨骼四苇、血液、肌肉方咆、腎臟等）月腋、內(nèi)胚層(呼吸道、消化道)

目前存在的問(wèn)題：組織中取出消化成單細(xì)胞瓣赂，但是這樣它們的位置信息就丟失了榆骚。

早期使用激光顯微切割技術(shù)：可以留下空間信息，但通量不夠

最近發(fā)表的：

a single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis =>E6.5-E8.5, nine developmental stages, 116,312 single cells => 37 cell types

the single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis =>

E9.5-E13.5, five developmental stages, 2,058,652 single cells => 38 major cell types

看到細(xì)胞量很大煌集，但它們都是不包含空間信息的妓肢，當(dāng)然是可以利用Pseudotime分析嘗試回歸空間信息。

想法：嘗試建立早期小鼠胚胎空間位置細(xì)胞信息“GPS系統(tǒng)"

一開(kāi)始選取了小鼠E7.0原腸中期胚胎苫纤，特點(diǎn)就是中胚層包裹到epiblast(外胚層)一半的程度

2011年開(kāi)始：冰凍切片（大概15?μm厚度）=》激光顯微碉钠，前后左右個(gè)20-30細(xì)胞=》scRNA

遇到的技術(shù)挑戰(zhàn)：
胚胎很懈倩骸（300μm）；小鼠之間的胚胎發(fā)育階段不完全一樣喊废，不容易準(zhǔn)確區(qū)分E7.0時(shí)期祝高；單個(gè)胚胎的顯微切割有難度；RNA降解

原腸運(yùn)動(dòng)中期E7.0在轉(zhuǎn)錄組層面可以將胚胎分為4個(gè)domain：前端污筷、后端褂策、側(cè)面的兩個(gè)

網(wǎng)站：iTranscriptome：包含超過(guò)2萬(wàn)個(gè)gene，輸入名稱得到在什么位置進(jìn)行表達(dá)以及表達(dá)量的高低颓屑、三維轉(zhuǎn)錄組重建、找到相似expression pattern的gene list

SCENIC pipeline ： Regulon analysis (gene regulatory network)耿焊，比DEG效果好揪惦；它不是完全看基因表達(dá)的差異，而是以轉(zhuǎn)錄因子為核心罗侯，每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子有一個(gè)binding specific cis-element器腋，這個(gè)cis-element在哪個(gè)基因中存在的話就是可能的target，然后看和這個(gè)基因一起上調(diào)或者下調(diào)表達(dá)的中有沒(méi)有相似的cis-element钩杰，算作一個(gè)TF Regulon纫塌。200多個(gè)樣本中20000個(gè)基因中找到了282個(gè)Regulon，然后用Regulon和它的activity再重新做所有的數(shù)據(jù)分析讲弄。

單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)-陳洛南

主要研究方向：網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)生物學(xué)措左、合成系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算系統(tǒng)生物學(xué)避除；利用系統(tǒng)工程怎披、動(dòng)力學(xué)分析、優(yōu)化和數(shù)學(xué)建模以生物復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)和動(dòng)態(tài)行為為主線來(lái)研究生命系統(tǒng)

我們測(cè)量的基因瓶摆、蛋白表達(dá)都是隨著時(shí)間凉逛、條件變化的，一個(gè)cell type中也是不斷變化的群井，并不是說(shuō)細(xì)胞一發(fā)生變化状飞，就意味著形成了不同的cell type。那么什么是穩(wěn)定的书斜？認(rèn)為調(diào)控關(guān)系是穩(wěn)定的诬辈，于是原假設(shè)就是：一個(gè)cell type中的調(diào)控關(guān)系是穩(wěn)定的。

目前一個(gè)細(xì)胞可以看到量菩佑，比如：

• expression
• protein expr
• metabolomics
• methylation

但是自晰，can we construct a network in a single cell?比如，就測(cè)了一個(gè)細(xì)胞的RNA-Seq稍坯、蛋白表達(dá)等酬荞，那么能不能得到映射出來(lái)的調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)搓劫？

利用CSN：cell specific network=>one net for one cell

先了解如何對(duì)多個(gè)細(xì)胞構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)？比如得到了100個(gè)細(xì)胞中5000個(gè)基因各自的表達(dá)量混巧，那么就是一個(gè)5000x100矩陣枪向，那么做一個(gè)兩兩的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，或者調(diào)控網(wǎng)絡(luò)咧党、因果網(wǎng)絡(luò)等秘蛔。總之傍衡，測(cè)出來(lái)多個(gè)細(xì)胞或者多個(gè)樣本深员，就可以得到網(wǎng)絡(luò)

對(duì)于一個(gè)細(xì)胞，主要基于獨(dú)立概率分布：

獨(dú)立概率分布

只要這個(gè)式子成立蛙埂，就證明它們之間沒(méi)有關(guān)系倦畅。

降維=》基因的度(每個(gè)基因連接個(gè)數(shù)) =》基因表達(dá)可能沒(méi)有差異，但是度存在差異"Dark gene"

認(rèn)為基因不穩(wěn)定绣的，度是穩(wěn)定的叠赐，只是變成一個(gè)穩(wěn)定的量，然后下面使用一般的聚類算法

1 NDM：network degree 《=》標(biāo)準(zhǔn)的GEM：gene expr

2 臨界理論：緩慢累積=》快速變化屡江，這是動(dòng)態(tài)過(guò)程芭概，重點(diǎn)在臨界點(diǎn)(由慢到快的接點(diǎn)tipping point)

DNB：dynamic network biomarker

Tipping point => critical transition => DNB =>drug target

pseudo-trajectory: 找臨界type，找到分化點(diǎn)branch point

3 細(xì)胞干性potency ：干細(xì)胞一個(gè)基因與很多基因都有關(guān)聯(lián)（調(diào)控關(guān)系很混亂惩嘉，每個(gè)細(xì)胞可以映射成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)罢洲，網(wǎng)絡(luò)熵很大），越往體細(xì)胞關(guān)聯(lián)越少

提問(wèn)：

多個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù)放在一起宏怔，基因組數(shù)據(jù)量大奏路，其他數(shù)據(jù)量小，放一起可以嗎臊诊？

• 需要做成獨(dú)立的變量鸽粉，基因、蛋白抓艳、甲基化映射到同一個(gè)空間触机，變成可比的=》data fusion

bulk與scRNA區(qū)別

• scRNA：一個(gè)細(xì)胞一個(gè)網(wǎng)絡(luò)，bulk是多個(gè)type的平均值

scRNA-seq腸癌病人ILC及受Sin1-mTOR調(diào)控的ILC2-陳磊

ILC：Innate lymphoid cells玷或，參與innate immune儡首，數(shù)量較少；lack of marker

ILC功能發(fā)展很快偏友，主要在小鼠研究

• type1：againgt tumor
• type2: 對(duì)抗寄生蟲(chóng)
• type3：對(duì)抗細(xì)胞外微生物

Q：腸癌病人有哪些類型ILC細(xì)胞蔬胯，功能是什么

• 拿到組織=》流式分選：3個(gè)病人癌+癌旁，同樣趨勢(shì)：ILC3下降位他，ILC1上升
• 高維流式：同樣ILC1上升氛濒，3下降
• scRNA产场，希望找到好的marker，分出細(xì)胞type

ILC sorting：

每個(gè)樣本Unsupervisede聚類舞竿，marker檢查=>每個(gè)細(xì)胞類型比例=》feature plot for newly discovered markers=>sub groups of ILC1

mTOR信號(hào)通路=》sin1=》sin1敲除的小鼠=》胚胎致死京景，sin1對(duì)胸腺發(fā)育重要；sin1敲除對(duì)ILC2影響最顯著

summary：

• 4 clusters of ILC2. Zeb2 cluster and Lgals cluster were regulate by Sin1
• MHC-II/CD74 highly expressed only in one specific ILC2 subset

單細(xì)胞試劑盒測(cè)定酶分子活性-江德臣

100nm孔直徑骗奖，毛細(xì)管電泳替代空氣泵

2018PNAS确徙，國(guó)內(nèi)首次測(cè)定單個(gè)細(xì)胞器的蛋白活性，每次吸一個(gè)細(xì)胞器执桌，管內(nèi)反應(yīng)完電信號(hào)改變排出鄙皇，然后再下一個(gè)

比如：吸取溶酶體，然后糖苷蛋白活性分析（單個(gè)溶酶體中葡萄糖苷活性）驗(yàn)證是否吸取成功

可以在單個(gè)細(xì)胞層面研究細(xì)胞器差異仰挣，單細(xì)胞多種酶活性聯(lián)合分析(所有試劑盒底物混合育苟，然后看每個(gè)細(xì)胞中是否有這個(gè)酶)，一天能做100個(gè)細(xì)胞

流式需要大量的細(xì)胞椎木，如果細(xì)胞量不夠可以用這個(gè)技術(shù)；還可以提供空間信息博烂，帶有目的性香椎；理論上可以吸取各種細(xì)胞器(目前做成功的是最好做的溶酶體)

噪聲魯棒性單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析-鄒欣

三個(gè)挑戰(zhàn)：技術(shù)噪聲、先驗(yàn)信息缺乏禽篱、高度稀疏

scRNA三個(gè)噪聲來(lái)源：

• 隨機(jī)：技術(shù)噪聲畜伐，如設(shè)備熱噪聲、PCR擴(kuò)增效率不同產(chǎn)生
• 系統(tǒng)性：非隨機(jī)但與生物過(guò)程相關(guān)躺率，如批次
• 生物學(xué)噪聲：生物學(xué)過(guò)程相關(guān)但與研究問(wèn)題無(wú)關(guān)玛界，如細(xì)胞周期變化對(duì)細(xì)胞類型判斷

算法：

• OGFSC：基因?yàn)V除，（一般設(shè)置人工閾值）悼吱，這里用算法替代人工慎框，多重線性回歸模型。另一種scmap算法會(huì)過(guò)濾掉大量DEGs

  與數(shù)據(jù)先驗(yàn)信息吻合：重新分析Science（它使用人工閾值）后添，結(jié)果產(chǎn)生差異

• SINCE：single-cell number of clusters estimation

  雙向聚類法=》基因表達(dá)譜二值化=》CERS統(tǒng)計(jì)量笨枯，評(píng)價(jià)聚類結(jié)果錯(cuò)誤風(fēng)險(xiǎn)=》比較不同的CERS判斷最優(yōu)結(jié)果

  可靠地描述數(shù)據(jù)系統(tǒng)性波動(dòng)

  首次闡述過(guò)分類錯(cuò)誤和欠分類錯(cuò)誤可能同時(shí)出現(xiàn)，可以使用SINCE迭代聚類分析策略

建議：如果要進(jìn)行scale遇西、Normalization(比如FPKM馅精、TPM)，有風(fēng)險(xiǎn)粱檀，可能引進(jìn)的bias比去掉的bias還要大洲敢。推薦不要對(duì)數(shù)據(jù)本身進(jìn)行操作，直接提取出數(shù)據(jù)更好一些茄蚯。

單細(xì)胞蛋白檢測(cè)技術(shù)- 丁顯廷

蛋白與核酸不同压彭，不能被擴(kuò)增"放大"睦优。做蛋白一般采用三種方法：流式、western blot哮塞、tissue上的免疫組化

最常見(jiàn)的單細(xì)胞多靶點(diǎn)檢測(cè)—流式：原理就是拿來(lái)一個(gè)細(xì)胞刨秆，可能存在很多的biomarker與疾病相關(guān)，但是這個(gè)沒(méi)辦法直接觀察忆畅。因此可以找一個(gè)熒光掛到其中一個(gè)biomarker上衡未；想看另外一個(gè)biomarker，就要換一種熒光家凯，以此類推缓醋。然后通過(guò)檢測(cè)熒光的expression，然后變相評(píng)估熒光標(biāo)記的biomarker的expression量绊诲。
改進(jìn)：熒光流式變?yōu)?strong>質(zhì)譜流式【熒光比較少（7種）送粱，而且光譜的overlap非常嚴(yán)重，不是特別好的標(biāo)簽掂之，但元素多（已知的非放射性同位素就有130多種）抗俄，更精確（分子量差1，就可以清楚知道是什么元素）世舰，通道數(shù)量多且無(wú)干擾动雹，同位素沒(méi)有背景（許多動(dòng)物組織有自發(fā)熒光，但是不存在自發(fā)同位素）】

可以用少量樣本獲得大量數(shù)據(jù)跟压，一般有三種信息需要重點(diǎn)關(guān)注：

• 表面身份證信息：CD4胰蝠、CD5、CD8震蒋、CD45茸塞，看這個(gè)細(xì)胞是誰(shuí)
• 表面功能信息：PD1、PDL1查剖、HER2是表面功能信息
• 細(xì)胞內(nèi)部變化信息：每個(gè)亞型的通路

血液金標(biāo)準(zhǔn)還不能完全確定腫瘤病人钾虐，單細(xì)胞組學(xué)可以輔助診斷

組織切片拓?fù)?空間學(xué)技術(shù)：免疫組化過(guò)程匯總不需要將組織消化成單個(gè)細(xì)胞，拿來(lái)切片直接掛上金屬標(biāo)簽笋庄，然后激光原位離子化禾唁，所有成分推到質(zhì)譜中檢測(cè)，可以直接從原位檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞125種靶標(biāo)檢測(cè)无切，得到幾乎所有感興趣的細(xì)胞種類荡短、細(xì)胞功能以及在拓?fù)鋵W(xué)上發(fā)生怎樣的變化

single cell western blot：蛋白上樣、分離哆键、固定（組蛋白或非組蛋白95%以上）掘托、免疫雜交

提高通量：將化合物做到了一個(gè)孔板上，將細(xì)胞種到孔板籍嘹，然后沿著孔板平行跑電泳：可以一個(gè)板處理100個(gè)細(xì)胞闪盔，每個(gè)細(xì)胞中6-7個(gè)蛋白的定量/半定量檢測(cè)弯院，豐度只需要2-10個(gè)拷貝就能檢測(cè)出，做一次時(shí)間<2h泪掀。適用于發(fā)育生物學(xué)听绳、干細(xì)胞分化、CTC研究异赫、小動(dòng)物樣本椅挣、腦脊液

肝臟細(xì)胞單細(xì)胞圖譜—張政

液體活檢

最早指病灶擴(kuò)散到血液的細(xì)胞，不止腫瘤

臨床分期不等于手術(shù)分期

CTC：circulating tumor cell

判斷細(xì)胞惡性程度：

• 細(xì)胞病例cytology
• FISH
• protein marker：EpCAM+/CK+/CD45-/DAPI+
• single cell
• Function assay
  • EPISPOT
  • metabolic assay: cancer hallmark 多種腫瘤共同擁有的特征(其中最簡(jiǎn)單的細(xì)胞能量代謝異乘可以做)

肝癌單細(xì)胞異質(zhì)性研究

肝癌異質(zhì)性是影響療效重要因素鼠证，靶向治療困難

多點(diǎn)取材+PDPCs研究空間異質(zhì)性

• 分支進(jìn)化
• 53.8%驅(qū)動(dòng)基因位于亞克隆
• 藥物靶標(biāo)全部位于分支

多點(diǎn)取材+PDPCs研究時(shí)空異質(zhì)性(6例病人，69個(gè)取材點(diǎn)) Journal of hapotology,2019

• 轉(zhuǎn)移可以是早期事件
• 多個(gè)克隆協(xié)同發(fā)生轉(zhuǎn)移
• 轉(zhuǎn)移灶藥敏改變靠抑，可以采用"敏感性治療"策略

單細(xì)胞全基因組解析肝癌克隆起源

• 多中心起源
  • 腫瘤間突變譜不同
  • 預(yù)后一般較好
• 肝內(nèi)轉(zhuǎn)移(單中心)
  • 腫瘤間突變普相似
  • 預(yù)后一般較差
  • 介入或靶向治療

單細(xì)胞全基因組測(cè)序：共30腫瘤細(xì)胞+正常

• 單克隆變異：CNV基本一致量九；"爆發(fā)性模式"
• 多克隆變異：CNV幾乎完全不同，"累積性"模式

它的結(jié)論：多結(jié)節(jié)腫瘤可能是多可克隆起源

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

• 免疫微環(huán)境：7個(gè)病人颂碧，有一個(gè)吃免疫抑制劑

  巨噬細(xì)胞>10群

通用型少量細(xì)胞表觀遺傳修飾譜分析新技術(shù)-趙小東

參與2003 ENCODE計(jì)劃

當(dāng)時(shí)使用PET(paired end ditag) tech + Sanger：兩端結(jié)合代表一段基因荠列，利用分子自身環(huán)化，但濃度不能太高

pipeline of ChIP-PET

胚胎干細(xì)胞：自我更新+多能性

觀點(diǎn)：200多種組織類型载城，遺傳物質(zhì)一致弯予，個(gè)體發(fā)育是表觀遺傳過(guò)程

生殖干細(xì)胞在哺乳動(dòng)物中存在：FGSCs

開(kāi)發(fā)了少量細(xì)胞-ChIPseq，做到了10個(gè)細(xì)胞个曙，還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞角度

scRNA是定義出單個(gè)細(xì)胞的中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，如何解析下游調(diào)控受楼？或許可以結(jié)合這里的單細(xì)胞表觀遺傳

所有基于chip分析都要抗體垦搬，抓取核酸

BD單細(xì)胞測(cè)序—中科普瑞

BD Rhapsody

上樣1000-20000細(xì)胞，捕獲率50-60%艳汽，最多獲得10000-12000細(xì)胞

細(xì)胞用綠色熒光標(biāo)記=》后期熒光檢測(cè)猴贰，綠色為活細(xì)胞，紅色為死細(xì)胞

80w磁珠河狐，直徑比微孔略小米绕，保證每個(gè)孔中都有磁珠，多余被沖掉

單個(gè)細(xì)胞裂解+mRNA捕獲

磁珠回收=》利用磁極吸取磁珠上捕獲的mRNA

得到報(bào)告：?jiǎn)渭?xì)胞數(shù)量馋艺、雙細(xì)胞比例等

抗體-oligo偶聯(lián)結(jié)構(gòu)栅干，主要應(yīng)用于：

• 膜表面通用抗原=>多樣本標(biāo)記
• 膜表面特異性抗原=》ab-seq(膜蛋白定量分析)

降低成本；減少批次效應(yīng)(上樣前標(biāo)記混合捐祠，實(shí)現(xiàn)一次上機(jī)碱鳞，一次建庫(kù)，一次捕獲)踱蛀；有效去除樣本間雙細(xì)胞(利用細(xì)胞標(biāo)簽)

基于抗體-oligo的蛋白檢測(cè)：后續(xù)發(fā)展方向

靶向測(cè)序

• 相對(duì)于mRNA窿给，檢測(cè)低豐度基因的靈敏度更高
• 僅關(guān)注幾百個(gè)基因
• 數(shù)據(jù)集更小

服務(wù)流程：45d

marker數(shù)據(jù)庫(kù)

• cellmarker：檢索細(xì)胞贵白、基因
• mouse cell atlas：浙大郭老師小鼠組織器官檢索
• cancer SEA：腫瘤特異性檢索
• CD marker handbook =》 BD提供，人和小鼠表達(dá)譜信息

10Xgenomics最新應(yīng)用—胡超博

截止18年崩泡，發(fā)表了400篇禁荒，10M細(xì)胞

lineage tracing by Cas9 and scRNA

feature barcode可以同時(shí)對(duì)

單細(xì)胞檢測(cè)CNV按照基因組上20Kb區(qū)域檢測(cè)

coming soon：

• 空間轉(zhuǎn)錄組分析(baocode：計(jì)算count+抓取位置信息)
• Chromium connect：全自動(dòng)細(xì)胞=》測(cè)序