前言

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率一直居惡性腫瘤之首掀潮。肺癌可分為兩種亞型，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell Lung cancer, NSCLC)和小細(xì)胞肺癌。NSCLC可進一步分為腺癌曹阔、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌茉盏，約占所有肺癌病例的80%鉴未。然而，腫瘤治療的主要手段仍然是手術(shù)結(jié)合放療和化療鸠姨。盡管越來越多的新型抗癌藥物和治療策略被用于治療非小細(xì)胞肺癌铜秆，但它們的療效仍不令人滿意。其中讶迁，腫瘤耐藥是臨床治療中導(dǎo)致治療失敗和患者死亡的主要原因连茧。因此，克服癌細(xì)胞的耐藥已成為癌癥治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題巍糯。

Elemene（欖香烯）是從中藥姜黃溫郁金中提取的抗癌藥物啸驯，其主要活性成分是β-elemene。越來越多的證據(jù)表明祟峦，盡管目前尚無發(fā)現(xiàn)其許多作用機制坯汤，但在肺癌、白血病搀愧、肝癌惰聂、宮頸癌和胃癌的治療中疆偿，β-elemene發(fā)揮了巨大的生理和病理作用。β-elemene在臨床上用于多種腫瘤的放療增敏和化療搓幌，可有效逆轉(zhuǎn)耐藥杆故。有研究表明，β-elemene可以逆轉(zhuǎn)EGFR抑制劑gefitinib（吉非替尼）的獲得性耐藥溉愁，但具體作用機制尚不清楚处铛。

近年來，越來越多的證據(jù)表明細(xì)胞自噬與癌細(xì)胞的耐藥密切相關(guān)拐揭。例如撤蟆，EGFR-TKIs誘導(dǎo)的高水平自噬對NSCLC細(xì)胞的死亡可以起到保護作用。然而堂污，在β-elemene介導(dǎo)的自噬逆轉(zhuǎn)gefitinib耐藥中的作用和機制尚不清楚家肯。

研究結(jié)果

1. 吉非替尼耐藥細(xì)胞系的構(gòu)建及特性分析

作者首先建立相應(yīng)的吉非替尼耐藥細(xì)胞系PC9GR和HCC827GR，使用梯度濃度的吉非替尼處理親代細(xì)胞約6個月盟猖。為了研究NSCLC親本細(xì)胞系(PC9和HCC827)和吉非替尼耐藥細(xì)胞系(PC9GR和HCC827GR)的耐藥情況讨衣，作者檢測了一系列細(xì)胞功能指標(biāo)，實驗結(jié)果顯示式镐，抗藥細(xì)胞的增殖活性顯著高于親本細(xì)胞反镇，凋亡率明顯低于親本細(xì)胞。同時娘汞，免疫印跡結(jié)果顯示切割的caspase-3和PARP在吉非替尼抗性細(xì)胞中的表達明顯低于親本細(xì)胞歹茶。進一步檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力，發(fā)現(xiàn)吉非替尼抗性細(xì)胞的遷移能力明顯高于親本細(xì)胞你弦。以上結(jié)果表明惊豺，成功構(gòu)建了吉非替尼抗性細(xì)胞系(PC9GR和HCC827GR)，比親本細(xì)胞具有更強的增殖和遷移能力鳖目，對吉非替尼表現(xiàn)出更強的耐受性。

2. β-elemene可逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌對吉非替尼的耐藥性

β-elemene已被用于臨床多種腫瘤的放療增敏和化療缤弦，可有效逆轉(zhuǎn)耐藥领迈。因此，作者檢測β-elemene能否逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌對吉非替尼的耐藥碍沐±晖保克隆形成和凋亡實驗顯示，β-elemene成功逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對吉非替尼的耐藥性累提。為進一步研究β-elemene與吉非替尼聯(lián)合治療的療效尘喝，PC9GR移植BALB/c裸鼠建立非小細(xì)胞肺癌動物模型，觀察β-elemene和吉非替尼的抗癌作用斋陪。結(jié)果顯示朽褪，相對于單用的β-elemene或吉非替尼置吓，β-elemene和吉非替尼聯(lián)用表現(xiàn)出協(xié)同抗腫瘤活性。體內(nèi)和體外的這些結(jié)果表明缔赠，β-elemene可以逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對吉非替尼的耐藥性衍锚。接著，為探討β-elemene逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥的可能機制嗤堰，通過iTARQ測序分析β-elemene與吉非替尼處理后蛋白表達的差異戴质。測序結(jié)果顯示，與吉非替尼單獨處理相比踢匣，β-elemene和吉非替尼聯(lián)合處理后告匠，SQSTM1的蛋白表達顯著升高，提示自噬可能參與了吉非替尼抗性的逆轉(zhuǎn)离唬。

3. β-elemene通過抑制自噬逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對吉非替尼的耐藥

作者基于已有的研究結(jié)果以及自噬在腫瘤耐藥過程中發(fā)揮重要作用后专，推測β-elemene可能通過自噬途徑逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對吉非替尼的耐藥。由于無血清培養(yǎng)基通常用于誘導(dǎo)自噬男娄，因此作者采用流式細(xì)胞術(shù)研究有無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞對β-elemene的敏感性行贪。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在無或低濃度處理下模闲，無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞凋亡率低于含血清培養(yǎng)基中細(xì)胞凋亡率建瘫，而高濃度的β-elemene處理則有相反的結(jié)果，提示無血清條件下可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬尸折，保護細(xì)胞免于凋亡啰脚，β-elemene可明顯抑制自噬過程。隨后实夹，通過聯(lián)合使用自噬抑制劑或敲降自噬通路蛋白橄浓，進一步說明β-elemene可通過抑制自噬降低吉非替尼耐藥細(xì)胞的生存能力。為探討β-elemene調(diào)控自噬的機制亮航，采用免疫印跡實驗檢測自噬通路蛋白表達水平荸实，與氯喹（CQ）的結(jié)果相似，β-elemene處理后LC3B-II和SQSTM1的蛋白表達顯著增加缴淋，尤其是在β-elemene和吉非替尼聯(lián)合處理的情況下准给。綜合以上結(jié)果表明，β-elemene可以逆轉(zhuǎn)吉非替尼的耐藥重抖，而自噬在吉非替尼耐藥過程中起著至關(guān)重要的作用露氮，可以保護耐藥細(xì)胞免于死亡。

4. β-elemene阻斷NSCLC細(xì)胞自噬流

先前的結(jié)果表明钟沛，β-elemene以類似氯喹的方式抑制自噬畔规。接下來，作者構(gòu)建GFP-RFP-LC3質(zhì)粒恨统，轉(zhuǎn)染細(xì)胞研究自噬流叁扫。激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示三妈，相比與對照組，氯喹或β-elemene處理的細(xì)胞中陌兑，綠色的熒光顆粒含量顯著增加沈跨，聯(lián)合處理的時候更為明顯。綠色熒光顆粒對溶酶體腔內(nèi)的酸性條件敏感兔综，紅色熒光顆粒表示酸性自噬溶酶體饿凛，黃色熒光顆粒表示GFP和RFP的共定位熒光，代表與酸性溶酶體融合前的自噬體软驰。這表明涧窒，β-elemene只能增加自噬體，而不能增加自噬溶酶體锭亏，這與經(jīng)典的自噬通量阻斷劑氯喹非常相似纠吴，透射電鏡得到了類似的結(jié)果。已有報道慧瘤，氯喹通過提高溶酶體的pH值來阻止自噬體成熟為自噬溶酶體戴已，并最終抑制自噬體和溶酶體之間的融合。作者推測β-elemene可能通過抑制溶酶體的酸化來抑制自噬锅减，為了證明這一推測糖儡，作者使用lyso-tracker紅色染料，用于鑒別酸化的囊泡腔室（用于檢測溶酶體的酸化）怔匣。結(jié)果顯示握联，紅色熒光顆粒的數(shù)量隨著β-elemene或氯喹濃度的增加而減少，而紅色熒光顆粒的數(shù)量正表明溶酶體酸化程度每瞒。隨后金闽，作者在動物體內(nèi)評估了β-elemene和氯喹對腫瘤細(xì)胞生長的影響。與細(xì)胞實驗一致剿骨，結(jié)果顯示代芜，與對照或單獨用藥相比，β-elemene和氯喹聯(lián)合治療后腫瘤的平均大小明顯減小浓利。綜合體外和體內(nèi)的實驗結(jié)果挤庇，表明β-elemene在NSCLC中可以通過類似氯喹的方式抑制自噬來逆轉(zhuǎn)吉非替尼的耐藥。

5. M6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬

越來越多的文章報道了m6A甲基化修飾在腫瘤發(fā)生和腫瘤發(fā)展中起著關(guān)鍵作用荞膘，包括細(xì)胞自噬和腫瘤耐藥罚随。為了探究m6A甲基化修飾在逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥過程中的作用機制玉工，作者進一步研究了β-elemene和吉非替尼對吉非替尼耐藥細(xì)胞中m6A甲基化修飾的影響羽资。結(jié)果顯示，β-elemene和吉非替尼顯著降低NSCLC耐藥細(xì)胞中m6A甲基化水平遵班，提示m6A甲基化修飾可能參與了吉非替尼耐藥逆轉(zhuǎn)過程屠升。免疫印跡實驗結(jié)果進一步顯示潮改，β-elemene顯著抑制了甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的表達，并呈劑量依賴性腹暖，但對Virilizer汇在、METTL14、WTAP等甲基轉(zhuǎn)移酶的表達無明顯影響脏答。為了進一步預(yù)測β-elemene在METTL3中最可能的靶域糕殉，我們使用了在線PDB和PubChem數(shù)據(jù)庫以及AutoDock工具軟件。經(jīng)預(yù)測殖告，β-elemene可直接結(jié)合并靶向于METTL3的S-腺苷腺苷甲硫氨酸結(jié)合域阿蝶。同時，作者利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析了METTL3在正常組織和肺腺癌組織中的蛋白表達差異黄绩，發(fā)現(xiàn)METTL3在肺腺癌患者中表達顯著增高羡洁。隨后，通過在吉非替尼耐藥細(xì)胞中敲降METTL3的表達爽丹，檢測METTL3在自噬通路中的調(diào)控作用筑煮。qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，敲除METTL3可顯著降低LC3B粤蝎、ATG5和ATG7的mRNA表達而增加SQSTM1的mRNA表達真仲，免疫印跡實驗也有類似的結(jié)果。綜上所述诽里，這些結(jié)果表明袒餐，β-elemene可以通過抑制METTL3介導(dǎo)的自噬來逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對吉非替尼的抗性。在自噬過程中谤狡，METTL3通過上調(diào)LC3B灸眼、ATG5和ATG7的表達正向調(diào)控自噬。

總結(jié)

在本研究中墓懂，作者確定了β-elemene在體外和體內(nèi)逆轉(zhuǎn)吉非替尼在非小細(xì)胞肺癌中的耐藥作用焰宣。機制上，β-elemene以氯喹的方式抑制自噬的后期過程捕仔，通過阻止溶酶體的酸化匕积，抑制自噬體成熟為自噬溶酶體，從而逆轉(zhuǎn)吉非替尼的耐藥性榜跌。令人驚訝的是闪唆，m6A甲基化修飾參與了這個逆轉(zhuǎn)過程，METTL3可以通過靶向ATG5钓葫、ATG7悄蕾、LC3B和SQSTM1來正向調(diào)控這一自噬過程。