Single‐cell transcriptomics reveal the intratumoral landscape of infiltrated T‐cell subpopulations in oral squamous cell carcinoma

單細胞轉錄組學揭示了口腔鱗狀細胞癌中浸潤T細胞亞群的腔內景觀

發(fā)表期刊：Mol Oncol

發(fā)表日期：2021 Jan 29

影響因子：6.574

DOI:??10.1002/1878-0261.12910

一扛门、研究背景

大量證據表明，腫瘤微環(huán)境（TME）的免疫浸潤和TME內惡性和非惡性細胞之間的異質性和相互作用對腫瘤生物學的不同方面至關重要纵寝。隨著微流控技術的進步论寨，單細胞RNA測序（scRNA-seq）的使用使得從活檢樣本中的數千個細胞能夠在單細胞水平上同時進行分析。

頭頸癌是全球第六大惡性腫瘤爽茴≌口腔癌的發(fā)病率約占頭頸癌的28%，口腔鱗狀細胞癌(OSCC)占口腔癌的90%以上闹啦，全世界每年新發(fā)病例超過35萬沮明，死亡病例超過17萬。OSCC的組織學等級可從分化良好的角化癌到未分化的非角化癌不等窍奋，且有較高的轉移傾向荐健。

二、材料與方法???

1?數據來源

1）本研究包括1名女性和2名男性患者琳袄，病理診斷為OSCC江场。從患者身上獲取新鮮的OSCC腫瘤和成對的相鄰正常組織，用于后續(xù)的淋巴細胞分離窖逗。相鄰正常組織距離腫瘤組織至少2cm址否。

2）使用的OSCC細胞系（HSC-3和CAL-33；均來自男性患者）

3）數據可用性聲明：scRNA-seq原始數據已存入NCBI序列讀取檔案（SRA）數據庫（PRJNA650256）

4）30例OSCC患者的匹配腫瘤和正常組織碎紊，對其進行免疫組化染色

?2?分析流程

1）單細胞采集和cDNA擴增：使用鉻單細胞控制器（10x Genomics）進行單細胞捕獲

2）文庫構建與測序

3）數據質量和過濾：使用Cellranger工具包（v3.0.2）獲得原始計數矩陣并進行過濾

4）簇和偽時間分析：使用R包'Seurat'對單細胞計數矩陣進行聚類分析佑附；根據簇標記和簇標簽從R包'SingleR'分配簇細胞類型；使用'DoHeatmap'函數表征簇仗考，同時使用R包'monocle 2'進行偽時間分析

5）基因本體富集分析：使用R包'clusterProfiler'確定簇的基因本體(GO)特征

6）人類T細胞的分離和活化（使用人外周血單核細胞）

7）細胞培養(yǎng)和凋亡試驗音同、羧基熒光素琥珀酰亞胺胺酯（CFSE）標記、雙熒光素酶報告試驗

三秃嗜、結果展示

01 -?腫瘤特征及單T細胞轉錄組數據生成

對從3例OSCC患者的腫瘤和鄰近正常組織中分離出來的FACS分選T細胞進行了scRNA-seq（圖1A）权均。在使用CD3、CD4和CD8的免疫組化染色（IHC）確認浸潤性淋巴細胞的存在后（圖1B）锅锨，從腫瘤和相鄰正常組織的單細胞懸液中分選Calcein+ CD3+活體浸潤性T細胞（圖S1）叽赊，并獲得共11866個細胞的單細胞轉錄組數據（圖1C）。腫瘤組織中CD8+T細胞的比例遠高于配對的相鄰正常組織（圖1C,D）必搞，表明由于腫瘤抗原的刺激必指，TME中CD8+細胞毒性T細胞可能富集。CD4:CD8比值降低顾画，表明抗原刺激的抗腫瘤免疫反應更加強大取劫。

圖1 用于單細胞RNA測序(scRNA-seq)的口腔鱗狀細胞癌(OSCC)樣本的總體特征

圖S1 使用熒光激活細胞分選法分離活的腫瘤浸潤淋巴細胞

02 -?TME的T細胞聚類和亞型分析

根據基因表達譜，作者在腫瘤中發(fā)現了14個不同的細胞簇研侣，包括9個CD8+T細胞簇谱邪，4個CD4+T細胞簇，1個γδT細胞簇庶诡，每個細胞簇都有獨特的標志功能（圖2A和S2A）惦银。根據其標志基因的表達來識別這些簇（圖S2B和S2C）。

圖S2 T細胞亞群的特征圖和基因熱圖

在不同的CD8+簇中末誓，簇0包括組織駐留的記憶T細胞(TRM)扯俱，因為ZNF683的高表達。圖2B,C）喇澡。這個TRM樣簇表現出來自效應標志物基因的高表達迅栅，該簇也顯示出免疫檢查點的高基因表達（圖2B,C）。

簇1通過NKG7晴玖、GZMB读存、GZMH和GZMA的基因表達，將TEM特征描述為效應器記憶T細胞（TEM）呕屎。簇3顯示了檢查點標志物的高表達基因让簿，這些標志物在耗竭的T細胞中也是高表達的（圖2C）。因此秀睛，簇3被定義為耗竭的T細胞（TEX）簇尔当，表明這可能在OSCC的T細胞耗竭中發(fā)揮重要作用。簇4顯示出高表達的細胞周期相關基因的標志物（圖2B,C）蹂安，可能是由于對癌癥新表位的免疫反應椭迎。根據CellCycleScoring，將簇4定義為有絲分裂的TEM簇田盈。雖然該簇表現出高IFNG表達侠碧，但它也和簇2一樣表達了高水平的檢查點分子（圖2B,D）。由于NKG7缠黍、PRF1弄兜、GZMB、GZMH瓷式、GZMA和IFNG等標記基因的高表達替饿，6、8贸典、9视卢、11和12五個簇被定性為TEM簇。此外廊驼，簇8和簇12顯示出晚期分化效應器和效應器記憶標記基因KLRG1的特異性表達（圖2B,C）据过。因相關標志物TRDC惋砂、XCL1和XCL2的基因表達，將簇13指定為γδT細胞簇绳锅。

還確定了四個主要的CD4+T細胞簇（圖S2C）西饵。簇2由大多數CD4+T細胞組成，由于明確的Treg標記物FOXP3的特異性mRNA表達鳞芙，被確定為調節(jié)性T細胞(Treg)群（圖2D）眷柔。該簇表現出共刺激分子基因的高表達，此外還有其他定義明確的Treg標志物原朝。與簇2相比驯嘱，被定義為有絲分裂的Treg簇的簇10表現出類似的基因表達譜。簇5表達了高水平的 "na?ve "標記喳坠，從而代表一組分化程度較低的效應記憶T細胞鞠评。簇 7表達了高水平的PDCD1和CTLA4 mRNA，這提示了耗竭的CD4+T細胞壕鹉。

圖2 在OSCC生態(tài)系統(tǒng)中CD8+和CD4+T細胞的表達異質性

03 -?偽時間分析揭示了OSCC浸潤淋巴細胞的動態(tài)狀態(tài)轉換情況

作者應用Monocle 2算法來構建CD8+和CD4+簇的潛在發(fā)育軌跡谢澈。

關于CD8+簇的軌跡（圖3A），分支的缺乏反映了不同前體的缺乏以及浸潤TME的CD8+T細胞的終末分化性質御板。簇8_CD8+ TEM和3_CD8+ TEX位于相鄰位置锥忿，表明在OSCC中，這兩個特斯拉細胞亞群是高度異質的怠肋，它們不應該被看作是一個同質的群體敬鬓。0_CD8+ TRM、4_CD8+有絲分裂TEM和9_CD8+ TEM三個增殖簇位于偽時間路徑分支的兩端笙各，說明它們與其他簇相比基因表達譜不同钉答。

利用CCR7、LEF1杈抢、PDCD1数尿、HAVCR2、LAG3等著名的簇標記來證明相關基因在偽時的動態(tài)變化（圖3B）惶楼。發(fā)現在T細胞分化過程中右蹦，na?ve相關標志物的mRNA表達水平急劇下降，而耗竭標志物和效應分子的mRNA表達水平逐漸上升歼捐，但在有絲分裂后期有所下降何陆，有絲分裂基因的表達在有絲分裂期達到高峰。

同樣豹储，分析了CD4+T細胞贷盲，包括四個分支（圖3C）。集群5_CD4+TEM剥扣，它表達高水平的na?ve標記mRNA巩剖，位于起點铝穷。偽時間軌跡演化成兩個方向，一個向簇7_CD4+TEM佳魔，另一個向簇2_CD4+Treg曙聂。隨著CD4+T淋巴細胞的分化，T細胞從幼稚狀態(tài)過渡到分支點4吃引，然后再過渡到調節(jié)狀態(tài)或耗竭狀態(tài)，代表了CD4+T細胞從幼稚T細胞分化到Treg或TEX的過程刽锤。在這個過程中镊尺，na?ve標志物mRNA的表達逐漸減少，而Treg標志物mRNA的表達急劇增加（圖3D）并思。此外庐氮，還發(fā)現了分支點4的分支依賴性基因（圖3E）。從狀態(tài)3過渡到狀態(tài)6的細胞宋彼，Treg相關蛋白的mRNA表達量很高弄砍，而當細胞過渡到狀態(tài)5時，效應分子和趨化因子的mRNA表達量增加输涕。

圖3 基因表達動態(tài)沿T細胞發(fā)育的偽時間進行

04 -?OSCC患者T細胞簇的功能異質性及預后價值

為了進一步了解OSCC浸潤淋巴細胞的功能異質性音婶，通過GO分析評估了CD8+和CD4+集群的差異表達標記基因（圖4A）。雖然離體再活化實驗已經證明CD8+耗竭的T細胞產生較少的效應細胞因子莱坎，但本分析顯示衣式，簇3_TEX也富集了與T細胞活化和功能相關的途徑，表明TEX細胞可能還沒有完全喪失體內的抗腫瘤效應潛能檐什。

為了進一步了解該簇的表型碴卧，分析了TCGA中獨立的HNSCC隊列。簇3具有預后價值（圖4B）乃正，與這些基因高表達的患者相比住册，簇3標志性基因低表達的患者總生存期明顯更好（圖4C）。集群0_CD8+ TRM突出地富集了免疫相關的途徑（圖S4A）瓮具，表明組織駐留記憶T細胞在實體瘤的控制中具有特殊的作用荧飞。

關于CD4+T細胞，富集包括 "JAK-STAT信號通路"名党、"Th17細胞分化"垢箕、"NOD樣受體信號通路"、"Th1和Th2分化 "和 "TNF信號通路"（圖4D）兑巾。簇2_CD4+ Treg細胞幾乎富集在所有相關途徑中条获，表明Tregs是一個功能活躍的效應細胞亞群（圖4D和S4B）。為了了解簇2在TME中的復雜作用蒋歌，利用TCGA的隊列中現有的基因表達數據帅掘，發(fā)現簇2具有預后價值（圖4E）委煤，Treg的低表達與更好的總生存率顯著相關（圖4F）。簇10_Mitotic Treg富集于 "細胞周期途徑"修档，而簇7_CD4+ TEM富集于 "PD-L1表達和PD-1檢查點途徑在癌癥中的應用"碧绞，表明T細胞衰竭的表型。集群5_CD4+ TEM除'T細胞激活'信號傳導外吱窝，其他與T細胞效應器功能相關的通路富集度最低讥邻。

圖4 OSCC患者各簇T細胞免疫信號的預后價值

圖S4 腫瘤組織簇0和2的免疫途徑相關的基因本體(GO)生物過程柱狀圖

05 -?正常組織浸潤的T細胞比較均勻

在正常組織浸潤的T細胞中只發(fā)現了3個CD8+簇（1、2和3）院峡，2個CD4+簇（0和4）兴使，以及一小簇自然殺傷（NK）T細胞（FGFBP2+，簇6）（圖5A和S5）照激。由于TRM標志物ZNF683的特異性表達发魄，簇3被定性為由組織駐留記憶T（TRM）細胞組成。除了種群下降（圖S6A）俩垃，簇3表達的效應分子遠少于腫瘤中的TRM励幼。簇1是正常組織中CD8+T細胞的主要效應子集，因為效應分子和趨化因子基因的高表達水平（圖5B）口柳，以及T細胞活化和功能途徑的富集（圖S6B）苹粟。

圖S5 與圖5A相關的正常組織T細胞群中關鍵基因的特征圖

此外，與原發(fā)腫瘤中的CD8+增殖亞群和衰竭亞群相比跃闹，正常組織中沒有CD8+增殖亞群和衰竭亞群（圖5C和S5）六水，說明正常組織中的CD8+T細胞處于相當靜止的狀態(tài)。關于CD4+T細胞辣卒，根據它們的標記基因確定了兩個集群的特征（圖5D）掷贾，T細胞的一個小的子集，簇4荣茫，由于FOXP3的特異性表達而被定性為Tregs想帅。Tregs在TME中的過度積累（圖S6）可能有助于免疫抑制性微環(huán)境。與CD8+ TRM相似啡莉，Tregs比它們的腫瘤對應物更靜止港准，因為它們表達低水平的共刺激分子和較低的T細胞活化途徑富集（圖5D）。通過TEM鑒定了簇0咧欣，并利用GO分析發(fā)現富集了TNF和NF-kappa B信號通路（圖S6D）浅缸。

圖5 正常組織中CD8+和CD4+T細胞的異質性

圖S6 對正常組織進行補充分析

06 - PD1和PDL1在OSCC中上調

正常和惡性口腔鱗狀上皮的IHC結果如圖6所示。PD1的表達在OSCC浸潤的淋巴細胞中上調(圖6A)魄咕，但在正常組織中浸潤的淋巴細胞中沒有上調(圖6B)衩椒，而PDL1的表達在OSCC腫瘤細胞中上調(圖6C)，但在正常細胞中沒有上調(圖6D)。這些結果表明毛萌，在OSCC中普遍存在PD1+耗竭的T細胞苟弛。

圖6 使用PD-1和PD-L1抗體進行免疫組化染色的結果（n = 30）

07 - T細胞表型提示調節(jié)劑調控OSCC抗腫瘤免疫反應

耗盡的T細胞廣泛存在于OSCC微環(huán)境中，為了確定參與調控瘤內T細胞耗盡的關鍵反式活性調節(jié)因子阁将，作者重點研究了差異表達基因（DEGs）中的轉錄因子膏秫，如圖2C所示。在作者的數據集中做盅，與胸腺細胞選擇相關的TOX表達呈強正相關的10個基因中缤削，有4個基因與T細胞耗竭相關（圖S7A），表明TOX是OSCC中T細胞耗竭的關鍵調控因子吹榴。

在TCGA HCSN患者隊列中亭敢，觀察到上述基因的表達與TOX的表達之間存在顯著的正相關關系（圖7A和S7B）。然而腊尚，KLF2和LEF1等na?ve相關基因與TOX的表達呈負相關吨拗。如圖7B所示满哪， TOX的過度表達導致編碼幼稚蛋白的基因表達減少婿斥，而編碼抑制性受體的基因和轉錄因子的表達增加。

圖7 和胸腺細胞選擇相關的TOX對人T細胞抗腫瘤功能影響的體外實驗

圖S7 與TOX表達相關的基因以及TOX對細胞凋亡的影響

由于TOX的表達與CD8+T細胞的耗竭密切相關哨鸭，作者探討了TOX在體外對人T細胞抗腫瘤功能的影響民宿。進行3次細胞凋亡實驗。如圖7C和S7C所示像鸡，經過12 h的共培養(yǎng)活鹰，PD1 OE組和TOX OE組腫瘤細胞的凋亡率明顯低于Ctrl OE組和TOX OE加抗PD1組。TOX過度表達對CD8+T細胞的影響可以被aPD1逆轉只估，說明PD1/PDL1軸在TOX過度表達導致的細胞毒活性降低中發(fā)揮了重要作用志群。

還在CD3/CD28刺激下，在T細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)了三種類型的人CD8+T細胞（Ctrl OE CD8+T細胞蛔钙、PD1 OE CD8+T細胞和TOX OE CD8+T細胞）锌云。用CFSE標記T細胞，在第2天收集吁脱，并使用流式細胞儀測量其增殖桑涎。如圖7D所示，PD1 OE CD8+T細胞和TOX OE CD8+T細胞與Ctrl OE CD8+T細胞相比兼贡，增殖率分別降低了20.4%和18.2%攻冷。

08?- 轉錄因子網絡分析顯示PRDM1是TOX的關鍵調控因子

由于TOX被證明在T細胞功能障礙中具有關鍵作用，使用單細胞調節(jié)網絡推理和聚類（SCENIC）來研究驅動TOX表達的潛在分子機制遍希。對于總的CD8+T細胞等曼，PRDM1調節(jié)子是SCENIC預測驅動TOX表達的前三個調節(jié)子之一（圖8A）。CD8+T細胞簇上調了驅動TOX表達的不同轉錄因子網絡的表達，PRDM1調節(jié)子在簇3中表現出高度的特異性涉兽，它們表達高水平的與功能障礙相關的基因（圖8B）招驴。利用JASPAR數據庫揭示了TOX啟動子中轉錄因子PRDM1的規(guī)范結合基團（圖8C）。用PRDM1過表達質粒和含有TOX啟動子的pGL3報告質粒電轉染人淋巴細胞系Jurkat細胞枷畏，結果表明别厘，PRDM1激活了TOX基因的轉錄（圖8D）。上述研究結果表明拥诡，PRDM1是T細胞浸潤OSCC中TOX表達的關鍵調控因子触趴。

圖8 PRDM1激活TOX基因轉錄

四、結論

在這項研究中渴肉，作者對3例OSCC患者從腫瘤中分離出來的11 866個單體T細胞和配對的相鄰正常組織進行了scRNA-seq冗懦。在腫瘤中發(fā)現了14個獨特的T細胞亞群，在正常組織中發(fā)現了5個亞群仇祭，說明TME的T細胞群體與正常組織的T細胞群體相比更具有異質性披蕉。對OSCC中浸潤性T細胞的scRNA-seq數據構成了寶貴的資源，豐富了對這些細胞在OSCC中功能的理解乌奇，并有可能帶來有效的免疫治療策略没讲。