summary:
sestrins保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷础淤，但是具體機(jī)制還不明確莹捡。Nrf2-keap1通過(guò)調(diào)控抗氧化酶調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激鬼吵。Sesn1 和Sesn2 與Nrf2 的抑制劑 Keap1, 自噬底物p62, 和泛素連接酶Rbx1相互作用。 這種抗氧化功能受P62相關(guān)的keap1自噬降解并激活Nrf2激活的調(diào)節(jié)篮赢。在大鼠肝臟中齿椅，經(jīng)過(guò)禁食和高碳水化合物再喂食后，sesn2表達(dá)上調(diào)启泣。（因?yàn)樵傥故澈蠹せ頟62涣脚，促進(jìn)keap1的降解和Nrf2的激活。）sesn2敲除抑制keap1的降解和Nrf2的激活寥茫，而且再喂養(yǎng)后脂質(zhì)的急性刺激增加了肝臟對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性遣蚀。
INTRODUCTION：
?p53的兩個(gè)靶基因Sestrin1 (Sesn1) 和Sesn2, 具有抗ROS的作用。其抗氧化作用可能與它們的亞磺酸還原酶活性有關(guān)纱耻。這種活性對(duì)于維持過(guò)氧化物酶(Prxs)處于活性狀態(tài)是必要的芭梯。Prxs是過(guò)氧化物酶的一個(gè)家族，其中半胱氨酸是過(guò)氧化物還原過(guò)程中氧化的主要位點(diǎn)弄喘。半胱氨酸過(guò)度氧化為亞磺酸使得Prxs失活玖喘。高氧滅活的Prx通過(guò)硫氧多辛(Srx)催化的反應(yīng)被重新激活。有人提出蘑志，Sesns還可以催化這種半胱氨酸-亞磺酸還原反應(yīng)累奈，從而通過(guò)維持Prx活性，抑制ROS積累急但。然而澎媒，sesn和Srx在氨基酸序列上沒(méi)有相似之處。Sesns不具有還原酶功能波桩。
盡管其潛在機(jī)制尚不清楚旱幼，但很明顯，sesn能保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激突委。在研究Sesn2對(duì)小鼠肝臟的保護(hù)作用時(shí)柏卤，在禁食在喂養(yǎng)過(guò)程中冬三，Sesn2對(duì)Srx激活是至關(guān)重要的。Srx基因是轉(zhuǎn)錄因子Nrf2(核因子紅系2相關(guān)因子2)的靶基因缘缚。Nrf2可調(diào)節(jié)許多抗氧化基因功能勾笆，keap1作為其抑制劑，可調(diào)節(jié)其作用桥滨。我們尋找Sesn2和Nrf2通路之間的聯(lián)系窝爪，發(fā)現(xiàn)Sesn2促進(jìn)Keap1的自噬降解，從而上調(diào)Nrf2信號(hào)齐媒，促進(jìn)Srx等抗氧化酶基因的表達(dá)蒲每。因此，我們確定了Sesn2通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化功能喻括。并保護(hù)小鼠肝臟免受急性脂肪生成刺激引起的氧化損傷邀杏。
RESULTS
1.Sesn2誘導(dǎo)Keap1降解和Nrf2活化
為研究Sesn2是否調(diào)節(jié)Nrf2-Keap1相關(guān)信號(hào)通路, 我們用慢病毒轉(zhuǎn)染表達(dá)FLAG epitope-tagged Sesn2 (F-Sesn2) 和HA-taggedKeap1 (H-Keap1)的細(xì)胞。
圖1A 顯示在HEK293 細(xì)胞 HCT116 和 HeLa 細(xì)胞過(guò)表達(dá)sesn2后唬血，keap1的蛋白水平降低望蜡，但mRNA（圖1B）未受到影響。（sesn1作用相同拷恨，見(jiàn)附件）
Sesns具有保守脖律，氧化應(yīng)激敏感性半胱氨酸殘基，如sesn2的C125腕侄。但是sesn2突變體C125半胱氨酸殘基替換成絲氨酸后小泉，keap1豐度依然降低了。
Keap1是Nrf2激活的抑制因子冕杠。
我們檢測(cè)了共表達(dá)F-Sesn2或F -Srx的HEK293細(xì)胞中，亞磺酸還原酶活性和Keap1豐度下調(diào)情況弊决。過(guò)表達(dá)F-Srx可以下調(diào)H2O2誘導(dǎo)的Prx,但對(duì)H2O2誘導(dǎo)的keap1豐度無(wú)影響噪舀。相反，過(guò)表達(dá)F-Sesn2飘诗，keap1含量降低与倡，Prx無(wú)影響。這些結(jié)果標(biāo)明sesn2不是亞磺酸還原酶昆稿，sesn2與Srx不分擔(dān)生物學(xué)功能纺座。
2.sesn2誘導(dǎo)的Keap1降解是由p62依賴(lài)的自噬介導(dǎo)溉潭，并由Rbx1促進(jìn)
調(diào)節(jié)sesn2-keap1通路蛋白有很多净响，其一是P62少欺，作為自噬底物與Nrf2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合keap1。
我們首先研究了Sesn2相關(guān)的Keap1豐度的下調(diào)是否與Keap1的降解有關(guān)馋贤？
（用自噬抑制劑證明由自噬介導(dǎo)）在共表達(dá) sesn2和Keap1的HEK293中赞别，加入蛋白酶體抑制劑MG132或自噬抑制劑氯喹或3-甲基-苯胺。免疫印跡分析表明配乓，MG132輕微增加了sesn2介導(dǎo)的Keap1豐度下降仿滔。而氯喹或3-甲基-苯胺減弱這種作用。表明 sesn2導(dǎo)致的keap1降解是由自噬介導(dǎo)的犹芹。
為了確定Sesn2是否刺激自噬腰埂，我們用共轉(zhuǎn)染F-Sesn2和H-Keap1的HEK293細(xì)胞飒焦，檢測(cè)LC3的脂化，這是自噬的一個(gè)特征盐固，可以將LC3- i亞型轉(zhuǎn)化為電泳上更具流動(dòng)性的LC3- ii亞型荒给。我們發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)sesn2可以增加LC3-II的含量刁卜。F-Sesn2使GFP-LC3的分布從彌漫性改變?yōu)榘|(zhì)點(diǎn)狀志电。后者代表脂化LC3對(duì)自噬體膜的修飾。
利用自噬缺陷進(jìn)一步研究了自噬的作用蛔趴。ATG7-de?cient (Atg7-/-), or p62-de?cient (p62-/-)自噬缺陷的MEFs細(xì)胞共轉(zhuǎn)染F-Sesn2 和H-Keap1挑辆。ATG7或p62的缺失阻止了Sesn2誘導(dǎo)的Keap1降解。
此外鱼蝉，p62的過(guò)表達(dá)以濃度依賴(lài)性方式增強(qiáng)了Sesn2誘導(dǎo)的Keap1降解。
（Rbx誘導(dǎo)的keap1降解箫荡，由sesn2增強(qiáng)魁亦，需要Clu3間接參與）與之前的觀察一致，Keap1的降解是由Rbx1的過(guò)表達(dá)引起的羔挡。在p62+/+MEFs中洁奈，M-Rbx1成濃度依懶性降解H-Keap1。P62-/-的細(xì)胞中不明顯绞灼。在sesn2+/+細(xì)胞比sesn2-/-的細(xì)胞更明顯利术。Rbx1導(dǎo)致的keap1的降解被sesn2增強(qiáng)。
Rbx1與Keap1相互關(guān)系由Cul3間接作用。在Cul3缺失時(shí)，Rbx1誘導(dǎo)H-Keap1降解作用明顯衰減轮蜕。
Keap1在正常(非應(yīng)激)條件下通過(guò)p62介導(dǎo)的自噬穩(wěn)定降解肠虽。已經(jīng)證明幔戏，p62通過(guò)Keap1相互作用域(KIR)和LC3相互作用域(LIR)直接與Keap1和LC3相互作用。在自噬體膜上形成LC3-p62-Keap1復(fù)合物可能是Keap1自噬降解的原因税课。已知Keap1被Cul3-Rbx1泛素化闲延，并經(jīng)歷蛋白酶體獨(dú)立降解。p62通過(guò)其泛素相關(guān)(UBA)結(jié)構(gòu)域結(jié)合了泛素相關(guān)蛋白韩玩，并將其導(dǎo)向自噬機(jī)制垒玲。我們?cè)谵D(zhuǎn)染F-Sesn2、H-Keap1和p62野生型或UBA缺失突變載體的HEK293細(xì)胞找颓，測(cè)試了p62 UBA結(jié)構(gòu)域在sesn2誘導(dǎo)的keap1降解中的作用合愈。p62缺乏UBA結(jié)構(gòu)域并不能阻止F-Sesn2誘導(dǎo)的keap1降解。
然而击狮，在沒(méi)有F-Sesn2的情況下劣摇，P62 UBA結(jié)構(gòu)域缺失涝桅，H-Keap1水平比未缺失的高镊尺。當(dāng)M-Rbx1水平升高時(shí)悲立，泛素化UBA結(jié)構(gòu)就沒(méi)那么有必要了。
這些結(jié)果表明档冬，當(dāng)Sesn2或Rbx1的濃度較低時(shí)膘茎，Keap1與p62相互作用形成LC3-p62-Keap1三元復(fù)合物。在Sesn2或Rbx1水平升高時(shí)并不需要酷誓，可能是因?yàn)镾esn2或Rbx1可以增強(qiáng)keap1和p62之間微弱的聯(lián)系披坏。
（敲除keap1,檢測(cè)Nrf2信號(hào)通路蛋白來(lái)驗(yàn)證通路。）為了檢測(cè)sesn2介導(dǎo)的Keap1降解是否介導(dǎo)Nrf2活化盐数，我們將F-Sesn2棒拂、p62和H-Nrf2載體轉(zhuǎn)染Keap1+/+或Keap1-/ -MEFs，并評(píng)估了三個(gè)Nrf2靶基因:Srx玫氢、NQO1和GSTA1的表達(dá)水平帚屉。Keap1的缺失完全阻斷了Sesn2誘導(dǎo)的三種nrf2靶基因的增加。表明Sesn2通過(guò)促進(jìn)Keap1的降解來(lái)表達(dá)它的抗氧化功能琐旁。
3猜绣、Sesn2特異性地與p62灰殴、Rbx1和Keap1相互作用
為了探索Sesn2是否與p62、Rbx1或Keap1相互作用，我們將HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染p62表達(dá)載體牺陶，M-Rbx1伟阔，或H-Keap1，連同F(xiàn)-Sesn2的載體掰伸，然后將細(xì)胞裂解物進(jìn)行共免疫沉淀分析皱炉。
為了確定F-Sesn2與p62或M-Rbx1的關(guān)聯(lián)是否通過(guò)keap1間接介導(dǎo)，我們?cè)贙eap1+/+或Keap1- / -MEFs中研究了它們之間的相互作用歧蕉。我們?cè)贙eap1+/+或Keap1- / -MEFs制備的F-Sesn2免疫沉淀物(圖3D)中檢測(cè)到p62灾部，在M-Rbx1免疫沉淀物(圖3E)中檢測(cè)到F-Sesn2，表明Sesn2與兩者之間的相互作用并不是通過(guò)Keap1介導(dǎo)惯退。內(nèi)源性keap1赌髓、p62和Rbx1也與f - sesn2共免疫沉淀(圖3F)。
F-Sesn2的C125S突變體與異位p62、M-Rbx1或H-Keap1的關(guān)系與野生型蛋白相似(圖S3A-S3C)榛鼎。
為了定位與Sesn2相互作用所需的p62、Rbx1者娱、Keap1區(qū)域抡笼，用HEK293細(xì)胞共免疫沉淀分析：M-p62、H-Rbx1黄鳍、orKeap1的各種缺失突變體的表達(dá)載體以及F-Sesn2的表達(dá)載體推姻。?
Nrf2依賴(lài)的抗氧化基因Srx、nqo1和GSTA1 mRNA的表達(dá)在夜間禁食后略有增加框沟，在再喂養(yǎng)16小時(shí)后逐漸顯著增加(分別為10-藏古、8-和12倍)，在36小時(shí)后再次下降忍燥。我們研究了Keap1降解是否可能導(dǎo)致這些Nrf2靶基因的誘導(dǎo)拧晕。免疫印跡分析顯示，夜間禁食不影響肝臟Keap1的豐度梅垄。然而厂捞，keap1的量在再喂養(yǎng)期間逐漸減少，在16小時(shí)后達(dá)到最低點(diǎn)(非禁食小鼠的水平的40%)，然后在36小時(shí)再次增加靡馁。（同時(shí)關(guān)注P62）
與此相反臭墨，Keap1 mRNA的數(shù)量不受禁食或再喂養(yǎng)的影響赔嚎。這些結(jié)果表明，Keap1蛋白的再攝取誘導(dǎo)下調(diào)可能與蛋白質(zhì)降解有關(guān)胧弛。
小鼠肝臟中p62的豐度不受夜間禁食的影響尤误，但在開(kāi)始補(bǔ)飼后6、16小時(shí)顯著增加叶圃，36小時(shí)下降袄膏。（見(jiàn)上圖）相反，Rbx1的量不受禁食或再喂養(yǎng)的影響掺冠。
綜上所述沉馆，小鼠肝臟中Sesn2的豐度在禁食16小時(shí)和再進(jìn)食16小時(shí)后均有相似程度的增加，補(bǔ)飼16小時(shí)后p62的含量增加德崭，但不是通過(guò)通宵禁食斥黑，禁食16小時(shí)后，Rbx1的表達(dá)量和Keap1的降解量沒(méi)有明顯增加眉厨，而Nrf2靶基因的表達(dá)量在禁食16小時(shí)后明顯增加锌奴，這些觀察結(jié)果，我們通過(guò)p62+/+或p62-/ -MEFs得到的結(jié)果表明憾股，p62對(duì)于Sesn2誘導(dǎo)的Keap1降解至關(guān)重要(圖2E和2F)鹿蜀，這表明同時(shí)增加Sesn2和p62的濃度對(duì)Keap1的降解至關(guān)重要。
4服球、在Keap1降解和nrf2活化過(guò)程中需要Sesn2
為了進(jìn)一步研究?jī)?nèi)源性Sesn2在Nrf2調(diào)控中的作用茴恰，我們讓Sesn2+/+或Sesn2- / -鼠禁食16小時(shí)，然后再喂食16小時(shí)斩熊。Sesn2+/+小鼠體內(nèi)Nrf2靶基因的mRNA豐度通過(guò)禁食增加到<2倍往枣，但通過(guò)再喂食顯著增加(Srx增加15倍，NQO1增加8倍粉渠，GSTA1增加25倍)分冈。蛋白印跡呈相同的趨勢(shì)。
這些結(jié)果表明霸株，Sesn2的消融導(dǎo)致與再喂養(yǎng)相關(guān)的Nrf2活化顯著減弱雕沉。
如圖所示，添加Sesn2+/+的小鼠肝臟中Keap1蛋白的含量降低了50%去件。但均不影響keap1的mRNA水平坡椒。Sesn2消融降低了p62基因的轉(zhuǎn)錄饺著。p62基因是Nrf2的靶點(diǎn)。
Sesn2+/+小鼠再喂養(yǎng)誘導(dǎo)p62 mRNA表達(dá)量增加肠牲。與P62的mRNA相比，P62蛋白在sesn2敲不敲中都增加靴跛。在沒(méi)有Sesn2的情況下降缀雳，自噬底物p62解要慢得多，如Keap1梢睛。
肝臟中S6磷酸化激活mTORC1肥印，在Sesn2+/+陽(yáng)性小鼠中，禁食3h后明顯降低绝葡。陰性小鼠沒(méi)有深碱。說(shuō)明，sesn2參與禁食中mTORC的激活藏畅。然而敷硅，在禁食3、6或9小時(shí)后愉阎，m TORC1的活性仍然受到抑制绞蹦，直到16小時(shí)后恢復(fù)到非禁食對(duì)照組小鼠的水平。而在禁食3榜旦、6幽七、9或16小時(shí)時(shí)，sesn2的量隨時(shí)間逐漸增加溅呢。這些結(jié)果表明澡屡，Sesn2可以抑制m TORC1的活性，
我們通過(guò)測(cè)量自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-II來(lái)評(píng)估Sesn2在自噬體形成中的作用咐旧。sesn2 +/+小鼠肝臟禁食3驶鹉、6小時(shí)后LC3-II的含量明顯低于Sesn2-/ -小鼠。盡管再喂養(yǎng)顯著降低了Sesn2+/+和Sesn2-/ -mice小鼠肝臟中LC3-II的含量休偶，但與Sesn2A / Amice小鼠相比梁厉，Sesn2+/+ +小鼠肝臟中LC3-II的含量仍然較高
.這些結(jié)果表明踏兜，sesn2和P62可以激活選擇性自噬词顾，降解keap1，當(dāng)mTORC1被激活時(shí)碱妆，自噬被抑制肉盹。
5、sesn2誘導(dǎo)的Nrf2激活可保護(hù)肝臟免受急性脂肪刺激引起的氧化損傷
禁食后再進(jìn)食會(huì)引起肝臟氧化損傷疹尾，通過(guò)H&E染色(圖6A)上忍、血清ALT水平(圖6B)和TUNEL法(圖6c和圖6D)檢測(cè)骤肛，Sesn2敲除導(dǎo)致肝臟損傷的增加更大。我們通過(guò)將Nrf2+/+ 或Nrf2- / -mice置于禁食-再喂養(yǎng)方案中窍蓝，研究了Nrf2對(duì)氧化性肝損傷的保護(hù)作用腋颠。正如預(yù)期的那樣，再喂養(yǎng)誘導(dǎo)了Nrf2+/+小鼠肝臟中Srx吓笙、NQO1和GSTA1基因的表達(dá)淑玫，而Nrf2- / -mice則沒(méi)有。這些結(jié)果表明面睛，sesn2依賴(lài)的Nrf2激活對(duì)保護(hù)肝臟免受再喂養(yǎng)引起的損傷至關(guān)重要絮蒿。
為了檢測(cè)Nrf2過(guò)表達(dá)是否能挽救Sesn2消融的損傷作用，我們給Sesn2-/ -小鼠尾靜脈注射通過(guò)腺病毒排出Nrf2 (Ad-Nrf2)或GFP (Ad-GFP)叁鉴，誘導(dǎo)小鼠肝臟轉(zhuǎn)位土涝，并對(duì)小鼠進(jìn)行再喂養(yǎng)。Ad-Nrf2的活性在Hep-a1c1c7小鼠肝癌細(xì)胞中得到了驗(yàn)證幌墓。注射Ad-Nrf2但壮，但不注射Ad-GFP，增加了非禁食小鼠和禁食小鼠肝臟中nrf2靶基因的誘導(dǎo)(圖7A和圖7B)以及細(xì)胞核中nrf2的數(shù)量(圖7C)常侣。
重要的是袭祟，Nrf2的過(guò)表達(dá)降低了Sesn2-/ -miceas再喂養(yǎng)引起的肝損傷的程度,與Ad-GFP相比验残，表現(xiàn)為更少的肝氣球樣變性，更低的ALT水平和細(xì)胞凋亡率巾乳。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了Sesn2通過(guò)Nrf2的激活保護(hù)肝臟免受再喂養(yǎng)誘導(dǎo)的氧化損傷您没。
DISCUSSION：
Nrf2的活性受Keap1負(fù)調(diào)控，Keap1是一種富含半胱氨酸的蛋白胆绊，通過(guò)Cul3-Rbx1 E3泛素連接酶復(fù)合物作為Nrf2泛素化的底物適配器氨鹏。蛋白酶體降解過(guò)程中，keap1結(jié)合Nrf2压状，并在非氧化應(yīng)激時(shí)將轉(zhuǎn)錄因子維持在低水平仆抵。Keap1通過(guò)其Kelch結(jié)構(gòu)域與Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，Keap1的BTB結(jié)構(gòu)域招募Cul3种冬。在本模型中镣丑，Keap1的Kelch結(jié)構(gòu)域結(jié)合Nrf2的的eh2結(jié)構(gòu)域的低親和力DLG模體結(jié)構(gòu) (latch)或高親和力ETGE 模體結(jié)構(gòu) (hinge)。在非氧化應(yīng)激條件下娱两，Keap1與Nrf2的DLG和ETGE基序結(jié)合莺匠，從而使Nrf2呈現(xiàn)正確的泛素化方向。氧化應(yīng)激時(shí)十兢，keap1結(jié)合其他區(qū)域趣竣，誘導(dǎo)sesn2構(gòu)象變化摇庙，并干擾其直接Nrf2泛素化的能力。因此遥缕，Keap1修飾的凈效應(yīng)是Nrf2不再在胞質(zhì)中降解卫袒，能夠轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核并誘導(dǎo)其目的基因的轉(zhuǎn)錄。
在本研究中单匣，我們發(fā)現(xiàn)sesn2的強(qiáng)迫表達(dá)誘導(dǎo)Keap1的降解和nrf2活性的上調(diào)玛臂，而sesn2誘導(dǎo)Keap1的降解主要是通過(guò)自噬而不是蛋白酶體介導(dǎo)的。此外封孙，在p62缺失的情況下，sesn2誘導(dǎo)的Keap1降解被消除讽营，這種現(xiàn)象還被Rbx1過(guò)表達(dá)所促進(jìn)虎忌。雖然Sesn的作用尚不清楚，但是之前已經(jīng)報(bào)道過(guò)通過(guò)Keap1降解激活nf2通路橱鹏，以及Rbx1和p62在Keap1降解中的作用膜蠢。P62是自噬缺陷細(xì)胞中，打破keap1-Nrf2并激活Nrf2的另一種蛋白莉兰。自噬受損導(dǎo)致P62積累挑围，P62通過(guò)kelch結(jié)構(gòu)域的KIR模體結(jié)合于keap1上，P62與Nrf2的ETGE基序相似糖荒，因此與Nrf2競(jìng)爭(zhēng)與Keap1的結(jié)合杉辙。p62是一種多面性的適配蛋白，通過(guò)與多種蛋白質(zhì)相互作用捶朵，促進(jìn)蛋白質(zhì)的聚集蜘矢，實(shí)現(xiàn)多種生物學(xué)功能。此外综看，通過(guò)其與LC3相互作用的能力品腹，p62調(diào)節(jié)自噬去除蛋白聚集和受損的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器
雖然已知與p62緊密結(jié)合的蛋白會(huì)與自噬底物一起降解，但目前的研究中红碑，keap1是否也通過(guò)與p62結(jié)合而降解舞吭，這一點(diǎn)還不清楚。在過(guò)表達(dá)Keap1的細(xì)胞中觀察到Keap1的降解析珊，但即使誘導(dǎo)p62降解羡鸥，在對(duì)照組細(xì)胞中也不明顯。這些觀察表明忠寻，p62和Keap1之間的相互作用并不強(qiáng)兄春，不足以使Keap1容易受到自噬降解，除非這種解離平衡被keap1的大量聚集所打破锡溯。
我們發(fā)現(xiàn)了sesn2與P62赶舆，keap1,Rbx1的相互作用哑姚，證明sesn2過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)keap1的降解。因此芜茵，Sesn亞型似乎可以作為支架蛋白叙量，增強(qiáng)keap1與p62之間微弱的聯(lián)系。Sesn2和Rbx1 誘導(dǎo)的Keap1降解完全依賴(lài)于p62九串。
為了研究Sesn2在生理環(huán)境中的作用绞佩，我們將小鼠分為禁食和再喂食。肝臟中sesn2的豐度是通過(guò)食物剝奪和再喂養(yǎng)來(lái)增加的猪钮，但這些增加可能是由不同的機(jī)制介導(dǎo)的品山。補(bǔ)飼增加了p62的含量，而禁食則沒(méi)有烤低。此外肘交，Sesn2在不同的代謝狀態(tài)下表現(xiàn)出不同的功能:在近視的情況下，sesn2與p62協(xié)同作用扑馁，激活mTORC1涯呻，促進(jìn)Keap1自噬降解∧逡基于我們的研究結(jié)果以及之前的研究結(jié)果复罐，我們提出了一個(gè)模型，揭示了sesn2在禁食和再進(jìn)食期間的豐度和功能的潛在調(diào)控機(jī)制雄家。
饑餓通過(guò)多種機(jī)制上調(diào)p53和下調(diào)TORC1活性效诅，涉及分子應(yīng)答到代謝改變。我們發(fā)現(xiàn)趟济，S6磷酸化反應(yīng)所反映的mTORC1活性在食物剝奪后3填帽、6和9小時(shí)在肝臟中顯著降低，但在禁食16小時(shí)后恢復(fù)到未禁食小鼠的水平咙好。(禁食抑制mTORC1)篡腌。禁食相關(guān)的自噬作用抑制mTORC的降解，但是自噬降解導(dǎo)致氨基酸的積累會(huì)重新激活mTORC勾效。禁食后嘹悼，sesn2-/-小鼠，mTORC活性及自噬 都被抑制层宫⊙罨铮基因毒性應(yīng)激通過(guò)激活p53抑制m torc1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);Sesn2對(duì)p53的這種作用至關(guān)重要。Sesn2?與AMPK, TSC1和TSC2等形成復(fù)合體萌腿，激活A(yù)MPK限匣，使TSC2磷酸化，因此也解釋了P53相關(guān)的mTORC1抑制所介導(dǎo)的DNA損傷毁菱。我們發(fā)現(xiàn)Sesn2的基礎(chǔ)水平足以下調(diào)AMPK-TSC1/TSC2-mTORC1通路米死，而Sesn2的進(jìn)一步積累并不能增強(qiáng)這一作用锌历。
禁食小鼠肝臟中Sesn2的誘導(dǎo)可能是能量傳感器AMPK和轉(zhuǎn)錄激活因子PGC1a下游的p53活化增加的結(jié)果。
16小時(shí)不進(jìn)食的老鼠肝臟中Sesn2的含量略高于復(fù)喂16小時(shí)的老鼠峦筒，Sesn2的上調(diào)伴隨著Keap1的降解究西，但前者沒(méi)有，可能是因?yàn)閜62的含量是通過(guò)再喂養(yǎng)而不是禁食來(lái)增加的物喷。禁食通過(guò)p53卤材、AMPK和mTORC1等多種機(jī)制激活大自噬，以提供額外的能量來(lái)源峦失。盡管禁食后sesn2蛋白含量上調(diào)扇丛，通過(guò)阻斷mTORC信號(hào)通路激活自噬，但keap1的含量并沒(méi)有降低尉辑。這一發(fā)現(xiàn)表明Keap1的降解不是通過(guò)宏觀自噬帆精，而是通過(guò)高度選擇性的自噬〔牡牛可能由于keap1降解與P62和一定量sesn2的存在。.禁食時(shí)肝臟keap1降解的缺失和ROS生成的缺乏吝镣，與此相一致的是Nrf2的激活也很小堤器。在饑餓條件下，P62不太可能降解末贾，激活其轉(zhuǎn)錄基因再供給已經(jīng)沒(méi)必要闸溃。觀察表明，禁食不影響p62 mRNA的水平拱撵。
禁食后用高碳水化合物辉川、無(wú)脂肪的飲食喂養(yǎng)老鼠，會(huì)引起肝臟中脂肪酸的積累拴测，從而引發(fā)急性脂肪生成反應(yīng)乓旗。肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸代謝導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生。因此集索，小鼠肝臟中mTORC1的激活和隨后脂肪酸的積累可能觸發(fā)ROS-FOXO通路屿愚，誘導(dǎo)Sesn2的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)务荆，再喂養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激妆距，提示通過(guò)再喂養(yǎng)誘導(dǎo)Sesn2表達(dá)，除ROS-FOXO通路外函匕，還可能通過(guò)m TORC1娱据、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和C/EBP的順序激活介導(dǎo)。小鼠肝臟p62水平的明顯升高也可能與m TORC1活性的上調(diào)有關(guān)盅惜。激活的m TORC1減弱自噬中剩，導(dǎo)致p62的積累忌穿。另一方面，通過(guò)FOXO和c /EBP信號(hào)誘導(dǎo)的p62和Sesn2的累積可能會(huì)將Keap1隔離在自噬體上咽安，從而促進(jìn)Keap1的降解伴网，從而激活Nrf2。同時(shí)妆棒，p62基因是nrf2的靶基因澡腾，p62積累和Nrf2激活，從而構(gòu)成一個(gè)正反饋回路糕珊。從我們的觀察中可以明顯看出动分，在Sesn2- / -mice中，通過(guò)再喂養(yǎng)誘導(dǎo)Nrf2靶基因的誘導(dǎo)作用明顯減弱红选。
在Sesn2+/+小鼠肝臟中澜公，通過(guò)再喂養(yǎng)，p62 m RNA的含量顯著增加喇肋，而在Sesn2- / -mice中則沒(méi)有顯著增加坟乾。這一發(fā)現(xiàn)可以解釋為，p62基因是Nrf2的一個(gè)靶點(diǎn)蝶防，在Sesn2+/+小鼠中甚侣，再喂養(yǎng)顯著激活Nrf2通路，而在Sesn2- / -mice中沒(méi)有间学。盡管補(bǔ)飼對(duì)sesn2 +/+和Sesn2- / -mice中p62 m RNA水平的影響不同殷费，但通過(guò)補(bǔ)飼兩種基因型的小鼠，p62蛋白的數(shù)量都有相似程度的顯著增加低葫。盡管在進(jìn)食后抑制自噬详羡，自噬處于低水平，但是當(dāng)營(yíng)養(yǎng)充分時(shí)嘿悬，蛋白的自噬降解會(huì)上調(diào)实柠。考慮到Keap1降解與自噬底物p62的降解相關(guān)善涨，肝臟P62mRNA的合成對(duì)補(bǔ)充P62的丟失是極其重要的主到。在Sesn2- / -mice的肝臟中，p62 mRNA未上調(diào)躯概，但p62的豐度明顯增加登钥，與sesn2 +/+小鼠相似，可能是由于sesn2缺失娶靡，keap1的降解（同時(shí)伴有P62的降解）被阻斷牧牢，而P62仍然可以繼續(xù)合成。事實(shí)上，再喂養(yǎng)誘導(dǎo)的Keap1降解在Sesn2+/+小鼠中發(fā)生塔鳍，但在Sesn2- / -小鼠中沒(méi)有發(fā)生伯铣，盡管這些動(dòng)物的p62蛋白水平相似。這進(jìn)一步支持了這樣的觀點(diǎn)轮纫，即p62的積累是不夠的腔寡，sesn2蛋白的支架功能對(duì)于這種效果是必不可少的。
喂食高碳水化合物的老鼠會(huì)在肝臟中積累脂肪酸掌唾，導(dǎo)致大量活性氧的產(chǎn)生放前。為了抗活性氧的產(chǎn)生，細(xì)胞通過(guò)激活Nrf2相關(guān)的信號(hào)通路產(chǎn)生Srx等抗氧化酶糯彬。我們?cè)赟esn2- / -和Nrf2- / -小鼠凭语，補(bǔ)充高碳水化合物后不能誘導(dǎo)這些抗氧化酶產(chǎn)生，導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷撩扒，表現(xiàn)為氣球變性似扔、血清ALT水平和凋亡細(xì)胞死亡的增加等。此外搓谆，Nrf2的異位表達(dá)降低了inSesn2- / -mice的肝損傷程度炒辉。因此，我們的觀察表明泉手，sesn2依賴(lài)的Nrf2激活對(duì)保護(hù)肝臟免受急性脂肪刺激損傷至關(guān)重要黔寇。此外，我們的數(shù)據(jù)表明螃诅，Sesn蛋白的抗氧化應(yīng)激功能是由于其促進(jìn)Keap1?p62依賴(lài)性的自噬降解啡氢，和Nrf2的激活状囱。
