SSH——抑制性差減雜交
差異表達(dá)cDNA(目標(biāo))存在于檢測(cè)子cDNA中而在驅(qū)趕子cDNA中缺失或豐度較低蚕捉。
檢測(cè)子與驅(qū)趕子雙鏈cDNA首先用四堿基限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生平末端。再把檢測(cè)子cDNA片斷分成兩份（1和2）分別與接頭1和接頭2連接，形成兩組檢測(cè)子叮叹，（1）和（2）译仗。接頭的末端無(wú)磷酸基團(tuán)消化胜茧，那樣每個(gè)接頭中只有較長(zhǎng)的鏈才能共價(jià)結(jié)合上cDNA的5?端褪尝。
SSH技術(shù)用了兩次雜交玖绿，第一次中把過(guò)量的驅(qū)趕子加到每份檢測(cè)子樣品中亏推。然后將樣品熱變性并退火学赛。檢測(cè)子單鏈cDNA片斷（a）被均化，即平均高吞杭、低豐度的cDNA濃度盏浇，使其基本相等。均化的發(fā)生是因?yàn)閾?jù)雜交的二級(jí)動(dòng)力學(xué)（19）芽狗，重退火過(guò)程中高豐度分子能更快產(chǎn)生同源雜交cDNA(b)绢掰。而且，檢測(cè)子的單鏈cDNA(a) 片斷中差異表達(dá)基因的cDNA被顯著富集，而 “共有的”非靶標(biāo)cDNA與驅(qū)趕子形成異源雜交體滴劲。
在第二次雜交中攻晒，經(jīng)過(guò)第一次雜交的兩份樣品被混合。只有保持均化并消減的檢測(cè)子cDNA能重新結(jié)合形成（b）,(c)和新的（e）雜交體班挖。這一階段加入的第二部分變性驅(qū)趕子進(jìn)一步定集了差異表達(dá)基因的部分（e）鲁捏。新形成的（e）雜交體具有能區(qū)分于第一、二次雜交中形成的雜交體（b）和 (c)的重要特征萧芙，就是其在5?端有不同的接頭序列给梅，一者來(lái)自于樣品1，一者來(lái)自于樣品2双揪。這兩個(gè)序列使得在PCR中用P1和P2這對(duì)各自對(duì)應(yīng)于接頭1和2外部的引物時(shí)动羽，可以優(yōu)先擴(kuò)增消減和均化的片斷（e）。要完成選擇性擴(kuò)增盟榴，在PCR進(jìn)程前需進(jìn)行一個(gè)延伸反應(yīng)補(bǔ)平這些分子粘性末端曹质，以便于引物退火。
在所有PCR循環(huán)中擎场，只有（e）型分子才能被指數(shù)級(jí)擴(kuò)增羽德。（b）型分子因含有長(zhǎng)反轉(zhuǎn)重復(fù)序列末端，而在每次變性－退火PCR步驟后形成穩(wěn)定的“鍋柄樣”結(jié)構(gòu)迅办≌玻“鍋柄樣”結(jié)構(gòu)不能作為指數(shù)級(jí)PCR的模板，因?yàn)殚L(zhǎng)接頭序列的分子內(nèi)退火比短得多的PCR引物與模板間的分子間退火要更優(yōu)先和穩(wěn)定（14站欺，15）姨夹。這就是抑制性PCR的效應(yīng)。而且矾策，（a）型和（d）型分子不含引物結(jié)合位點(diǎn)磷账，（c）型分子只能以線性速率被擴(kuò)增。只有（e）型分子在其末端具有不同的接頭序列贾虽，使其能夠在PCR中得到指數(shù)級(jí)擴(kuò)增逃糟。描述（e）片斷形成過(guò)程和富集率的數(shù)學(xué)模型與計(jì)算將另行給出（20）
