如何選擇正確的方法進行細胞的支原體檢測烹看？支原體的檢測方法有哪些？目前實驗室常用的支原體檢測方法有培養(yǎng)法洛史、熒光指示細胞法惯殊、PCR 法、掃描電子顯微鏡法也殖，這些方法各有優(yōu)缺點土思。各實驗室可根據(jù)具體情況，選擇不同的方法忆嗜，或幾種方法聯(lián)合使用己儒。
一、培養(yǎng)法
培養(yǎng)法為最為經(jīng)濟可靠的方法捆毫，但其實驗周期較長闪湾，所以常用來進行對懷疑細胞的最后甄別。常用于細胞及臨床治療細胞的支原體檢查绩卤。
（一）材料與設(shè)備
1. 精氨酸肉湯培養(yǎng)基?? 按說明稱量粉劑途样，蒸餾水配制， 高壓除菌（加20％胎牛血清）濒憋。
2. 支原體瓊脂培養(yǎng)基?? 按說明稱量粉劑何暇，蒸餾水配制，高壓除菌（加20％胎牛血清）凛驮。
3. 其他?? 超凈工作臺赖晶、無菌吸管、試管架辐烂、培養(yǎng)試管／皿遏插、37°C 培養(yǎng)箱。
（二）操作步驟
1. 樣品的儲存纠修。樣品取材后胳嘲，最好盡快進行檢測。樣品如在24h 以內(nèi)進行支原體檢測扣草， 可儲存在2~8℃; 如果超過24h 樣品應(yīng)放置于－20℃ 以下保存了牛。-20℃保存的樣品，進行檢測時需重新加入到對照培養(yǎng)細胞中辰妙，培養(yǎng)72h 后鹰祸，取上清直接進行接種檢測。
2. 準備精氨酸肉湯培養(yǎng)基密浑、支原體瓊脂培養(yǎng)基（半流體）蛙婴。
3. 將樣品分別接種到10ml 精氨酸肉湯培養(yǎng)基、半流體培養(yǎng)基中（已冷卻至36℃） 尔破，每支培養(yǎng)基接種樣品0.5~ 1.0ml. 每種樣品接種6 支精氨酸肉湯培養(yǎng)基街图，3 支半流體培養(yǎng)基浇衬。
4. 接種6d 后，取3 支精氨酸肉湯培養(yǎng)基中樣品0.5 ~ 1.0ml. 復(fù)種于精氨酸肉湯培養(yǎng)基中餐济。
5. 36 ℃ 培養(yǎng)29d, 每隔3d 觀察一次耘擂。記錄實驗結(jié)果。
（三）結(jié)果判斷
培養(yǎng)結(jié)束時絮姆，精氨酸肉湯培養(yǎng)基如有支原體生長醉冤，則液體顏色改變（粉色或黃色) 。
半流體培養(yǎng)基中如有支原體生長篙悯，則出現(xiàn)絮狀沉淀
二蚁阳、熒光指示細胞法?
熒光指示細胞法較為快捷，方法簡單辕近，但其靈敏度有一定的欠缺， 易造成漏檢匿垄。
常見的支原體檢測方法中最簡單移宅、最經(jīng)濟的方法是熒光指示細胞法。該方法使用的熒光染料是煙酸己可堿椿疗，其激發(fā)波長為350nm（紫外激發(fā)）漏峰，發(fā)射波長為420nm。該染料會結(jié)合到DNA 中富含A-T 的區(qū)域届榄，由于支原體的DNA中A-T 含量占多數(shù)(55%~80%）浅乔，所以可被染色而檢測到。支原體污染的細胞經(jīng)染色后铝条，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點靖苇，即為支原體DNA, 證明該細胞有支原體污染。
（一）材料與設(shè)備
1. 熒光顯微鏡班缰。
2. CO2?培養(yǎng)箱贤壁。
3. 無菌小爬片。
4. 無菌培養(yǎng)皿埠忘。
5. 不含抗生素的完全培養(yǎng)液脾拆。
6. 二苯甲酰胺熒光染料濃縮液(50μg/ml) 。稱取5mg 二苯甲酰胺熒光染料加入100ml 不含酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 平衡鹽溶液中莹妒，在室溫下用磁力攪拌30~40min, 使完全溶解名船，－20℃ 避光保存。
7. 二苯甲酰胺熒光染料工作液(0.5μg/ml) 旨怠。取1ml 上述濃縮液渠驼，加至100ml 無酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 溶液中，終濃度為0.5μg/ml 鉴腻。
8. 固定液渴邦，即乙酸：甲醇(1 : 3) 溶液為細胞固定液疯趟。
9. 封片液。0.1mol/L枸櫞酸22.2ml, 0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 27.8ml, 丙三醇50.0ml谋梭，以上三者混勻信峻，調(diào)pH 至5.5 。
10.不含酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 平衡鹽溶液或PBS瓮床。經(jīng)多種方法檢測確定為支原體陰性的VERO 細胞盹舞。
（二）操作步驟
1. 無菌收集待測細胞上清：懸浮細胞離心后取上清液。
2. VERO 細胞爬片：將小爬片無菌置于小培養(yǎng)皿內(nèi)隘庄，滴加VERO 細胞懸液(細胞濃度約3×104 個/ml) 2~3ml, 置于CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h 使其貼壁踢步。
3. 制備標本。向6 孔板內(nèi)滴加待檢細胞上清液約1ml, 注意設(shè)立對照組（已證實的支原體陽性和陰性細胞上清液）丑掺，培養(yǎng)48h 后( VERO 細胞匯合前）將細胞爬片從平皿中取出获印。
4. 漂洗—將細胞爬片置于培養(yǎng)皿中，用不含酚紅街州、NaHCO3 的Hanks 溶液（或PBS) 漂洗3次兼丰。
5. 固定—用乙酸：甲醇(1 : 3) 固定液固定 10 min 。
6. 漂洗—待固定液自然風(fēng)干后用去離子水漂洗3 次唆缴。
7. 染色—置于Hoechst 33258 工作液(0.5μg/ml) 中染色10 min 鳍征。
8. 漂洗—去離子水中漂洗3 次，每次1 ~2min 面徽。
9. 封片艳丛，紫外激發(fā)，觀察趟紊。
（三）結(jié)果判斷
當(dāng)陰性及陽性對照結(jié)果均成立時氮双，結(jié)果有效 。
1. 陰性結(jié)果?僅見待檢細胞的細胞核呈現(xiàn)藍色熒光霎匈。
2. 陽性結(jié)果?熒光顯微鏡下細胞周圍或細胞膜表面可見大小不等眶蕉、不規(guī)則的藍色熒光小點和絲狀點。
（四）小結(jié)
1. 嚴格配制工作液及封片液唧躲。
2. 保證作為指示細胞的VERO 細胞沒有被支原體污染造挽。
3. 必須同時設(shè)立陽性及陰性對照， 注意重復(fù)弄痹，以排除假陽性和假陰性結(jié)果饭入。4. 應(yīng)全面觀察爬片，并注意可疑陽性的熒光點是凋亡小體還是支原體污染肛真。
5. 可適當(dāng)調(diào)整熒光染料的工作濃度和染色時間谐丢，避免出現(xiàn)非特異性染色，如胞漿著色。
三乾忱、PCR 法??
PCR 法檢測支原體的方法最為快速讥珍、靈敏、取樣量少窄瘟，既可做細胞本身衷佃，也可做細胞上清的檢測，同時可以檢測多種支原體的污染蹄葱，是目前常用的檢測手段氏义。但其成本較高，條件要求嚴格图云，且有時易出現(xiàn)假陽性或假陰性惯悠。彌補的方法是對懷疑的樣品要經(jīng)過3 次PCR 檢測，或用培養(yǎng)法檢測竣况。
PCR 法是20 世紀80 年代中期建立起來的一種體外DNA 擴增實驗克婶，其基本原理是酶促DNA 合成反應(yīng)，即在DNA 模板丹泉、引物和脫氧核糖核酸存在下情萤，經(jīng)DNA 聚合酶的作用，使DNA 鏈擴增延伸嘀掸。該實驗具有靈敏度高紫岩、特異性強规惰、檢測快速的特點睬塌，但其對實驗環(huán)境要求嚴格， 實驗成本較高歇万， 有時還會出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象揩晴。
（一）材料與設(shè)備支原體
PCR 檢測試劑盒、dNTP 贪磺、TaqDNA 聚合酶硫兰、緩沖溶液、瓊脂糖寒锚、礦物油劫映、超凈工作臺、PCR 儀刹前、電泳儀泳赋、凝膠成像分析系統(tǒng)、臺式離心機喇喉、旋渦混旋器等祖今。
（二）操作步驟
1. 樣品的收集。待測細胞用無雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)7d，用無菌容器取上清液500μl ,4℃ 保存待測千诬。
2. 模板的制作耍目。在無菌的條件下， 取細胞培養(yǎng)上清1 00μl 于一無菌的0.5ml塑料離心管內(nèi)徐绑，蓋好蓋子邪驮， 95 ℃ 水浴加熱5min 。
3. 打開蓋子泵三，向管內(nèi)加StrataClean Resin 10μl耕捞，蓋好蓋子，旋渦混懸器混合烫幕，離心5~ 10s, 吸取上清至一新的塑料離心管中俺抽，模板制作完畢， 4℃ 保存较曼。
4. PCR 反應(yīng)磷斧。反應(yīng)體系的最適條件為10mmol/L Tris-HCI (pH 8.38), 50 mmol/L KCI, 1.5~ 2.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP, 2U Taq DNA 聚合酶捷犹，總反應(yīng)體系為50μl 弛饭， 反應(yīng)用去離子水均需用紫外燈照射。
（1）在0.5ml 塑料離心管中加入35.2μl 去離子水及5μl 10 xTaq 反應(yīng)緩沖溶液萍歉。
（2）依次加入下列成分：0.4μl dNTP (25mmol/L）侣颂、0.4μl Taq 酶(5U/μl ) 、2μl引物枪孩。
（3）加2μl 去離子水憔晒，總體積45μl 。
（4）加5μl 已制成的模板到反應(yīng)體系中蔑舞。
（5）陽性對照拒担，內(nèi)對照各5μl 加入到各自的反應(yīng)體系中个盆。
（6）取1支含有以上反應(yīng)體系的離心管蒙幻，加入5μl 去離子水作為陰性對照管。
（7）在反應(yīng)體系中加入100μl 礦物油仍律。
（8）PCR 程序見下表钧栖。
5. 瓊脂糖凝膠電泳低零。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，進行瓊脂糖凝膠電泳拯杠，瓊脂糖凝膠濃度為2%掏婶。電泳結(jié)束后，凝膠成像分析結(jié)果阴挣。6. 結(jié)果分析气堕。該方法為檢測支原體的定性方法，在電泳泳道上， Marker茎芭、陽性對照揖膜、內(nèi)對照均會出現(xiàn)不同的電泳條帶， 當(dāng)被檢樣品泳道出現(xiàn)明亮條帶梅桩，且位置在陽性對照和內(nèi)對照條帶位置之間壹粟，即可認為該樣品被支原體污染 。
有時還會發(fā)現(xiàn)一條泳道出現(xiàn)多條宿百，可能是該樣品感染2 種以上支原體所致趁仙。如果泳道內(nèi)條帶隱約出現(xiàn)，則可懷疑有支原體污染垦页，重做該樣品雀费。
（三）注意事項PCR 反應(yīng)的前期操作應(yīng)在無菌環(huán)境中進行。注意假陽性痊焊、假陰性盏袄，有時需多次重復(fù)。?
四薄啥、掃描電子顯微鏡法?
掃描電子顯微鏡法：掃描電子顯微鏡法非常直觀辕羽、準確，對使用環(huán)境要求高垄惧，操作復(fù)雜刁愿，實驗周期較長，常作為樣品的最后定性檢測到逊。
（一）原理
利用電子顯微鏡的超級放大功能铣口， 直接觀察培養(yǎng)細胞中支原體污染情況。
（二）材料與設(shè)備
待檢測細胞蕾管， 0.05％胰蛋白酶／0.02%EDTA 枷踏、2.5％的戊二酸菩暗、1％鋨酸掰曾、0.1mol/L磷酸緩沖溶液（ pH7.4 ) ，掃描電鏡及相關(guān)設(shè)備停团。
（ 三）操作步驟
1. 將待檢測細胞傳代至貼有蓋玻片的培養(yǎng)皿中旷坦。
2. 37°C , CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h , 取出蓋玻片。
3. 以PBS 洗滌3 次佑稠。
4 . 以2 .5％戊二醛/PBS 固定15min , PBS 洗滌秒梅。
5 ．以1％鋨酸固定30min, PBS 洗滌。
6 . 乙酸異戊酯脫水舌胶。
7. CO2 冰點干燥捆蜀。
8. 噴金。
9 . 掃描電鏡觀察，照相辆它。
（四）結(jié)果分析
支原體感染會使培養(yǎng)細胞慢慢枯萎誊薄，因此對培養(yǎng)細胞定期進行支原體檢測非常重要。一般來說每1至3個月就應(yīng)該進行一次支原體檢測锰茉。將定期支原體檢測常規(guī)化堅持下去呢蔫，是細胞培養(yǎng)實驗室應(yīng)對支原體感染的關(guān)鍵。
