文獻翻譯：CoBATCH 一個基于單細胞的ChIP-seq技術
> SUMMARY
? 缺乏一種有效的闻葵，可推廣的全基因組方法單細胞組蛋白修飾或染色質結合蛋白的定位方法忘朝。在這里，我們開發(fā)CoBATCH沼撕，組合條形碼和目標染色質剪切患民，用于捕獲單細胞全基因組的蛋白結合區(qū)域. 融合到Tn5轉座酶的ProteinA通過特異性抗體富集到基因組區(qū)域羔挡，Tn5產生片段加上index签财，準備進行文庫制備和測序。 重要的是淹朋，這種方法不僅能在完整的組織中實現低細胞量的表觀基因組圖譜笙各，而且還能在自然條件和交聯條件下，對數萬個單細胞的實驗. CoBATCH在極低細胞量情況础芍，每個細胞可以測到12000 條reads. 通過CoBATCH,對10個小鼠胚胎器官的內皮細胞譜系進行定位杈抢，可以有效地破譯細胞群的表觀遺傳異質性和順式調控機制。 因此仑性，不依賴專門的設備惶楼，CoBATCH可以廣泛適用于單細胞水平蛋白質- dna相互作用.
> INTRODUCTION
? 單細胞測序技術目前被廣泛用于研究發(fā)育與疾病相關細胞群體異質性和繪制細胞圖譜。隨著技術的發(fā)展诊杆，這項技術正逐漸將生命科學研究推進到新的維度歼捐。在單細胞表觀組領域，雖然DNA甲基化測序晨汹、染色質構象捕獲技術豹储、染色質開放程度測序已經分別在2013年 (scRRBS)、2013年 (single cell Hi-C)宰缤、2015年 (scATAC-seq)實現了單細胞水平測序颂翼。研究基因表達調控與細胞命運決定的機制晃洒，最直接的證據是特定染色質區(qū)域與蛋白的相互作用慨灭，然而朦乏，高效的單細胞染色質免疫共沉淀測序（scChIP-seq）技術尚未出現。
? 蛋白質和DNA相互作用的染色質免疫共沉淀技術（ChIP-seq）技術是研究表觀遺傳調控的一種重要手段氧骤，常規(guī)ChIP-seq技術需要使用超聲打斷交聯的基因組片段呻疹，然后用特異性抗體富集含有目的蛋白結合的基因組片段，并將目的DNA片段純化后筹陵，進行建庫測序刽锤。這一系列操作使得ChIP-seq需要百萬個細胞作為起始材料。為減少ChIP-seq技術對細胞數目的要求朦佩，近年來并思，一些適用于少量細胞起始的ChIP-seq技術被逐漸開發(fā)出來，包括MOWChIP语稠，STAR-ChIP和ULI-NChIP等宋彼。雖然Drop-ChIP第一次實現了單細胞水平ChIP-seq，然而這一技術依賴特殊的微流控裝置仙畦，并且每個細胞只能捕獲到約800個DNA片段输涕，這極大地限制了這項技術的推廣應用。隨后開發(fā)的scChIC-seq雖然實現了單細胞水平的解析慨畸，但是獲得的單細胞數據的基因組比對率只有約6.1 %莱坎，大大增加了測序成本，且通量較低寸士。另外檐什，Cut&Tag需要依賴Takara ICELL8這一特殊裝置。綜上弱卡，目前還缺乏一種具有普適性厢汹，易操作，高質量的單細胞ChIP-seq技術谐宙。
本文報道了一種新的具有普適性烫葬、易操作、高通量和高質量的單細胞ChIP-seq技術凡蜻，將單細胞表觀組學新技術的研究搭综、普及和應用往前推進了一大步。研究者把這一新型單細胞技術命名為CoBATCH（combinatorial barcoding and targeted chromatinrelease）划栓。這一單細胞技術不僅適用于各種組蛋白修飾兑巾，同時也能捕獲DNA結合蛋白質在基因組上的結合信息。利用這一單細胞技術，研究者首次解析了小鼠胚胎10個不同器官（心臟洋魂、肝臟、肺绷蹲、左腦堂油、右腦修档、后腦、腎臟府框、皮膚吱窝、肌肉和小腸）的內皮細胞譜系發(fā)育、分化和功能的異質性迫靖。
> RESULTS
研究人員首先開發(fā)了一種新的適用于少量起始細胞的技術院峡，并命名為in situ ChIP（即不需要消化分離細胞組織）。在這一技術中 系宜，作者將Protein A蛋白與轉座酶Tn5的N端進行融合得到融合蛋白Protein A-Tn5 (PAT)照激。將目的細胞與特定抗體孵育之后，向細胞中加入PAT融合蛋白并與特定的抗體結合盹牧。之后俩垃，激活PAT的反應活性，被抗體識別的特定基因組區(qū)域能被PAT切割欢策，并帶上接頭序列吆寨。終止反應后，帶上接頭的目的DNA片段能直接用于PCR和建庫 . 我們獲得了高質量的ChIP-seq結果踩寇，最低100細胞就可以進行（通過和ENCODE bulk IGV track 比較）.
值得注意的是啄清，由于低噪音，在非重復read 達到5M 時候俺孙，辣卒，與重復及其公共數據的peak交集比率就很高。作者發(fā)現CoBATHC方法睛榄，不僅在激活marker 與ATAC-seq 重疊比例高荣茫，而且對于抑制marker 也有很好的效果。實驗進一步證實在low-input 時候场靴，表現也很出色.
接下來啡莉，我們測試了原位 ChIP方法是否可以直接應用于細胞稀少的組織. 為此，我們進行了剖析
H3K4me3和H3K27ac在發(fā)育中的小鼠胚胎中的分布旨剥，揭示了從E6.5到E7.75的表觀基因組動態(tài)變化咧欣。 E6.5 (660 cells), E7.0(4,500 cells), E7.75 (15,000 cells ） ，全基因組尺度的散點圖表明轨帜，在三個發(fā)育階段魄咕，樣品都具有很高的可重復性 。我們對于不同階段的H3K27ac 信號進行GO富集分析發(fā)現蚌父，都和各自發(fā)育階段密切相關（ such as ‘‘formation of primary germ layer’’ and ‘‘gastrulation’’ in E6.5, ‘‘mesoderm development’’ in E7.0, and ‘‘mesoderm morphogenesis’’ and ‘‘S-shaped body morphogenesis’’ in E7.75 ）. 我們的數據發(fā)現在 原腸胚形成過程中哮兰，識別出大量高度動態(tài)的增強子毛萌，為進一步分析功能順式調控元件和在這個重編程過程中推斷關鍵轉錄因子提供了資源(圖1F)。
image.png(A)說明low-input ChIP的主要步驟喝滞。藍色棒棒糖代表染色質結合蛋白或組蛋白標記阁将，如H3K27ac ，H3K4me3和H3K27me3囤躁。PAT表示蛋白A和Tn5融合蛋白冀痕。
(B)track 圖顯示H3K27ac和H3K4me3信號荔睹，在特定的位點展示三個時期細胞信號(E6.5狸演、E7.0和E7.75)。
(C和D)散點圖顯示了H3K4me3 (C)和H3K27ac (D)信號的生物重復之間的相關性僻他。
(E)(左)繪制了階段特異性增強中心周圍±1 kb區(qū)域的歸一化H3K27ac信號宵距。對每個階段的兩個數據進行合并，使用MACS2來call 全基因組的增強子peak吨拗，不包括基因近端啟動子的區(qū)域满哪。階段特異性增強峰:只在每個stage 唯一出現的峰。(右)由GREAT（R包）確定的階段特異性增強子相關的GO術語(生物過程)劝篷，P值采用二項式檢驗計算哨鸭。
(F) H3K27ac在原腸胚形成過程中的peak動態(tài)變化。紅色柱狀圖(上)表示H3K27ac峰只出現在更加成熟的Stage娇妓，而紫色柱狀圖(下)表示H3K27ac峰只出現在更加年輕的Stage像鸡。
我們通過組合標引設計將該方法擴展到單個細胞的檢測(CoBATCH)。 細胞和抗體進行反應后哈恰，一起分配到96孔板中只估，每一個孔200-2000細胞，每一個孔加入不同的T5/T7組合標簽. 一起混合后着绷，再分配到一個或者多個96 孔板中蛔钙，每個孔20-25個細胞，每個孔含有不同的i5/i7 PCR index primers.
pilot 測試中荠医，將等量的mouse ESC和human HEK293T 細胞進行混合吁脱， 假設每個條形碼組合對應于一個小鼠或人類細胞，其reads應分別比對到到小鼠或人類基因組 .我們發(fā)現大約有7% 撞車發(fā)生（通過barcode 無法區(qū)分細胞的情況）彬向，說明絕大多數都可以正常de-barcode.
對于native 和fixed 實驗方法兼贡，分別獲取了2161和2388個單細胞結果，為了結果可靠幢泼，過濾掉那些細胞中reads 數目少于3000 的細胞紧显，圖中可以看到native 和fixed 情況，結果Spearman相關系數也很高.
圖D 展示了特定區(qū)域bulk/agg sc/200 signal cell IGV 信號情況缕棵，可以看到單細胞信號很少出現在非peak區(qū)域. fixed 條件下每個細胞獲得9247 個reads; native 條件下每個細胞獲得12000個reads.
我們通過FRIP 結果也可以得到相同的結果.
image.png(A) CoBATCH工作流程示意圖
(B) 散點圖顯示每個獨特的barcode組合的低撞車率 孵班。小鼠ESCs與HEK293T細胞1:1混合涉兽。我們隨機選擇100個單細胞進行人鼠混合實驗。
(C)使用來自小鼠ESCs中native 和fixed 兩種條件下H3K27ac CoBATCH數據篙程。統(tǒng)計peak 區(qū)域斯皮爾曼相關系數枷畏。
(D) IGV track展示來自特定位點的bulk ChIP和CoBATCH數據的H3K27ac信號∈觯總共2,161個單細胞和200個單細胞track進行可視化拥诡。bulk的H3K27ac的ChIP數據來自于ENCODE
(E)在去除細胞中reads 數目低于3000個細胞后,小鼠ESCs中2161個單細胞的非重復reads的分布情況。紅線表示2161個單細胞的平均非重復reads(每個細胞12,000 reads)
(F)以隨機的reads分布為對照的氮发，小鼠ESCs中H3K27ac CoBATCH數據FRiP的小提琴圖渴肉。小提琴圖中的方框表示上四分位數和下四分位數(第25和第75百分位數)
內皮細胞組成了哺乳動物體內的脈管系統(tǒng)，和血液循環(huán)爽冕、造血仇祭、免疫、壓力感應以及器官形態(tài)建成等生命活動密切相關颈畸。研究者應用CoBATCH技術解析了小鼠胚胎期16.5天乌奇，來自10個器官的Cdh5+ 譜系的內皮細胞的H3K27ac水平的異質性 . 同時文獻報道了很多不同組織的標記基因，比如Gata4 (心臟)眯娱，Foxf1(肺)等等礁苗。通過層次聚類發(fā)現， limb muscle,skin, and small intestine 和其他組織不太一樣徙缴， 有趣的是试伙，雖然來自右腦和后腦的ECs按照預期聚集在一起，但來自左腦的ECs卻出奇地遠娜搂，而且與來自肝和肺的ECs表現出更高的相似性 .
為了評價10個器官的功能異質性迁霎，我們采用LSI方法（類似PCA）的降維方法降低矩陣維度。 最后得到單細胞的增強子熱圖（20112 H3K27ac peak;2,758 cell）
通過聚類產生了4個增強子cluster,3個細胞cluster百宇，其中C3進一步細分為3個小簇(C3a考廉、C3b和C3c)，以更好地用 module-specific,enhancer-regulated 解釋基因功能.
為了更好的描述不同增強子module 的功能携御，我們進行了de novo TF 富集昌粤，及其用GREAT進行GO富集。
聚類結果顯示啄刹，由增強子module 4定義的C1與免疫應答和淋巴細胞激活相關涮坐，表明有些ECs已經擁有了不同器官的特異性的功能(圖4 e)，包括很多免疫相關的TF,比如FOS-JUN,IRF4等等. 也可以看到C3c 細胞簇誓军，在module1-3很富集袱讹，但是module-4 不富集，說明這個細胞簇不太可能與免疫有關系.
為了更好的展示10個器官的enhancer 表觀異質性，我們將所有的ECs細胞捷雕，運用MDS方法椒丧，降低到兩維，和圖D結果類似救巷，心臟組織和腎組織細胞重疊到一起了.
image.png(A) 單細胞H3K27ac CoBATCH 實驗設計壶熏，選取E16.5時期細胞，通過Cdh5 標記進行FACS分選浦译，進行CoBATCH實驗棒假。
(B) 展示在ECs 標記基因處，不同類別單細胞分別合并后精盅，在IGV展示信號情況.
(C) 展示了組織特異性marker 處帽哑，不同類別單細胞分別合并后，在IGV展示信號情況.
(D) 利用全基因組H3K27ac信號對10個小鼠器官的單細胞聚合,進行5-kb 為windows size 的層次聚類結果
(E) 將H3K27ac 位點及其細胞分別進行了層次聚類渤弛，使用HOMER進行每個enhancer module de nove TF, 使用GREAT進行GO富集分析祝拯。使用二項分布進行P-Value甚带。
(F/G) 使用多維標度(MDS)對10個小鼠器官的H3K27ac信號進行分層聚類她肯，通過(E)和(F)中識別的聚類(F)顯示10個小鼠器官的共2758個單個ECs 細胞(G)。我們使用最commonly的20112個位點鹰贵，計算每個細胞的count 數目晴氨，將計數矩陣轉換為二進制矩陣作為降維的輸入。
為了證明此方法的廣泛適用性碉输，作者進行了cardiac EC的RNA Pol II和H3K36me3 單細胞CoBATCH實驗籽前，為了評估異質性，我們使用cisTopic 來降低單細胞調控矩陣的維度及其用UMAP可視化四個細胞簇敷钾。通過EC 標記基因枝哄，從圖A or B, 可以很清楚的區(qū)分出EC（C2,C4） 和非EC細胞(C1，C3).
同時我們通過cluster的標記基因可以看出四類細胞的大體位置. 比如Ephb2 標記C3 類阻荒，Ephb4 標記C1類挠锥。
GO富集也反映出類似結果，和期望一樣侨赡，C1和免疫過程有關系蓖租，暗示著脫離EC 狀態(tài)的命運。H3K36me3 進行了類似分析.
image.png(A) 通過topic 貢獻對852個Cdh5 標記的細胞進行UMAP降維可視化羊壹。 使用基于密度的方法對聚類進行了識別蓖宦。C1-C4的每個簇分別包含159個(19%)、468個(55%)油猫、70個(8%)和155個(18%)細胞稠茂。
(B) 通過EC標記基因最近的信號值計算出EC score.
(C) Col1a1, Irf8, Ephb2, and Ephb4 分別是mesenchymal cells, macrophage-like cells, arterial EC, and venous EC的標記基因. 圖中點反映出細胞中此信號的強度.
(D) 展示出四類細胞的topic score,通過cisTopic 計算得到.
(E) 展示出每一類細胞中顯著富集的5個通路.
這些研究結果證明了CoBATCH可以解析不同器官來源的內皮細胞表觀異質性以及順式作用元件在發(fā)育過程中的動態(tài)變化，為理解器官功能特異的內皮細胞發(fā)育提供了重要線索情妖。
> Conclusion
簡而言之睬关，CoBATCH技術是第一個具有普適性嚣州、高質量、高通量的單細胞ChIP-seq方法共螺，該技術將在單細胞水平上為解析細胞命運決定和功能異質性的表觀遺傳調控機制提供強有力的支持该肴，并對研究器官發(fā)育和疾病發(fā)生過程具有重大的意義。
總結：
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該方法是一篇關于單細胞ChIP實驗的文章藐不，講述了從原位ChIP匀哄，及其衍生出的單細胞ChIP技術--CoBATCH，采用類似smartseq2 一樣的雏蛮，多標簽策略涎嚼。特別是采用了P蛋白-Tn5 技術，可以改善實驗效果挑秉，比如Cut-tag 技術都采用類似原理法梯。
另外此實驗不會基于特殊儀器來完成，減低了實驗門檻.
文中出現了不同的降維方法犀概，LSI (類似PCA進行降維立哑，效果稍微好一些) ；MDS 多尺度放縮姻灶，明顯的特點降維后保留樣本間距離信息铛绰。U-MAP 降維類似T-SNE降維方法，可以很好展示細胞聚焦和演化變化
聚類方法：采用了基于密度的方法产喉。（區(qū)別于層次聚類捂掰，KNN聚類）
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