影響因子：7.3
研究概述：作為最致命的乳腺癌亞型画株，三陰性乳腺癌（TNBC）是一種侵襲性極強的內(nèi)分泌惡性腫瘤，復(fù)發(fā)率和遠處轉(zhuǎn)移率都很高啦辐。盡管化療和新輔助免疫療法在改善患者預(yù)后方面取得了進展谓传，但許多患者仍會產(chǎn)生化療耐藥性耕驰。TNBC患者出現(xiàn)化療耐藥的可能性各不相同烙无。一種推測認為，它與腫瘤微環(huán)境（TME）密切相關(guān)奸腺。與其他亞型相比侥衬，TNBC具有獨特的TME庸推，為癌細胞與周圍的內(nèi)皮細胞常侦、免疫細胞和成纖維細胞相互作用創(chuàng)造了有利的環(huán)境，可刺激病情進展贬媒。作為T細胞的一個特殊亞群聋亡，T調(diào)節(jié)細胞（Tregs）可抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，并通過抑制T細胞增殖和細胞因子的產(chǎn)生來防止自身免疫际乘。TME浸潤的Tregs可通過激活免疫抑制和促腫瘤生成信號來創(chuàng)造免疫抑制環(huán)境坡倔，從而減少對化療和放療反應(yīng)的影響。Tregs在TME中的潛在作用和Treg細胞的潛在治療靶點可能為TNBC的腫瘤免疫療法提供新的干預(yù)措施脖含。本研究利用WGCNA確定了METABRICTNBC樣本中與Treg浸潤相關(guān)的模塊罪塔。隨后，根據(jù)與Treg浸潤相關(guān)的模塊建立了預(yù)后模型养葵。隨后證明Treg浸潤相關(guān)基因模塊可用于建立TNBC進展的臨床相關(guān)分類征堪。本研究揭示了TK1作為腫瘤生物標記物和免疫治療靶點的潛力。研究流程如下：

正常乳腺上皮細胞和TNBC組織的scRNA-seq分析

從GSE125449中提取并重新分析了21個樣本的scRNA-seq數(shù)據(jù)关拒。在這些樣本中佃蚜，13個來自正常乳腺組織，8個來自TNBC着绊，基于細胞marker定義了六個細胞群（圖A）谐算。為探索NKT細胞的異質(zhì)性，作者將NKT細胞進一步分為5群（圖B）归露。由于Treg細胞有利于腫瘤抑制性微環(huán)境的形成洲脂，而腫瘤抑制性微環(huán)境會促進腫瘤進展并降低對免疫療法的反應(yīng)，因此作者探討了腫瘤形成過程中Treg細胞浸潤的變化剧包，發(fā)現(xiàn)與正常乳腺組織相比恐锦，Tregs在TNBC組織中的浸潤明顯增加（圖C、D）疆液。

根據(jù)Treg浸潤對TNBC腫瘤進行分層

為了確定與Tregs浸潤相關(guān)的關(guān)鍵標記基因踩蔚，作者使用CIBERSORT算法對Treg浸潤進行量化，并使用WGCNA檢測與Treg浸潤相關(guān)的基因模塊枚粘。在METABRIC隊列中發(fā)現(xiàn)了10個基因模塊，其中藍色基因模塊與Treg浸潤呈正相關(guān)飘蚯，與患者生存狀態(tài)呈負相關(guān)（圖A）馍迄。利用METABRIC隊列中的生存數(shù)據(jù)和藍色模塊基因的表達值，作者使用單因素cox回歸使進行了生存分析局骤，并確定了22個與Treg浸潤相關(guān)的預(yù)后基因攀圈，然后根據(jù)這22個基因的表達值對METABRIC隊列中的患者進行了無監(jiān)督聚類（圖B）與主成分分析（圖C）。圖D熱圖顯示峦甩，這22個基因的表達模式在群組1和群組2之間存在差異赘来。關(guān)聯(lián)臨床信息现喳，與群組1相比，群組2患者的腫瘤分級犬辰、分期更高嗦篱，生存狀況更差（圖E）。生存分析也顯示幌缝，Cluster2組的預(yù)后比Cluster1組差（圖F）灸促。考慮到TNBC患者可能對多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性涵卵，作者使用oncopredict包評估了這兩個群組對四種TNBC化療藥物的反應(yīng)浴栽，發(fā)現(xiàn)群組1中的患者對這四種常見化療藥物更敏感（圖G）。

Treg浸潤相關(guān)預(yù)后模型的構(gòu)建與驗證

為了促進Treg浸潤相關(guān)基因在預(yù)后中的臨床應(yīng)用轿偎，作者采用了LASSO和RF兩種機器學習算法從所有22個Treg浸潤相關(guān)基因中分別篩選出17和13個關(guān)鍵基因典鸡，其中有7個交叉基因（圖A），多因素Cox回歸模型證明了其獨立危險性（圖B）坏晦。隨后作者構(gòu)建了風險評分萝玷，將METABRIC隊列中的患者分為兩組，Treg浸潤相關(guān)風險評分較高的患者OS較差（圖C）英遭，時間ROC曲線也展示了其良好的預(yù)測性能（圖F）间护，這些結(jié)果在兩個外部隊列（GSE58812和SCAN-B）中得到了驗證（圖D,E,G,H）。

高風險和低風險評分組免疫相關(guān)特征的差異

為了揭示各風險評分組在通路激活方面的差異挖诸，作者計算了基于KEGG通路基因集的GSVA評分汁尺。圖A表明高風險評分患者的代謝相關(guān)通路，而高風險評分患者的免疫相關(guān)通路的活化程度較低多律。此外痴突，METABRIC隊列和SCAN-B的CIBERSORT算法結(jié)果顯示，與低風險評分患者相比狼荞，高風險評分患者的B細胞和CD8T細胞浸潤較低辽装，但Treg細胞和M2-巨噬細胞浸潤較高（圖B）。有趣的是相味，高風險組的腫瘤突變負荷（TMB）水平低于低風險組（圖C）拾积。此外，作者還發(fā)現(xiàn)了免疫檢查點表達在低風險組和高風險組之間的差異丰涉，顯示高風險組患者的免疫檢查點基因表達低于低風險組（圖D）拓巧。最后，作者計算了風險評分基因與免疫細胞浸潤之間的相關(guān)性一死，結(jié)果表明大多數(shù)基因與促進免疫治療反應(yīng)的免疫細胞浸潤（B細胞肛度、CD8T細胞）呈負相關(guān)，而與Treg細胞浸潤呈正相關(guān)（圖E）投慈。

評估藥物和免疫療法反應(yīng)

作者收集了一個包含TNBC患者免疫治療數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集GSE173839承耿。兔兔A表明免疫治療無反應(yīng)者的風險評分高于免疫治療有反應(yīng)者冠骄，圖B表明高風險評分組免疫治療失敗的患者比例高于低風險評分組。此外加袋，ROC曲線分析表明凛辣，Treg浸潤相關(guān)風險評分在預(yù)測免疫治療反應(yīng)性方面表現(xiàn)出色（圖C）。作者采用了使用CTRP和PRISM衍生的藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)來確定在Treg浸潤相關(guān)風險評分較高的患者中藥物敏感性較高的候選藥物锁荔。首先蟀给，在高Treg浸潤相關(guān)風險評分組和低Treg浸潤相關(guān)風險評分組之間進行差異藥物反應(yīng)分析，以確定在高Treg浸潤相關(guān)風險評分組中估計AUC值較低的化合物（log2FC>0.10）阳堕。接下來跋理，作者利用AUC值與Treg浸潤相關(guān)風險評分之間的斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)，篩選出相關(guān)系數(shù)為負的化合物恬总。這些分析得出了10種CTRP衍生化合物（包括SGX-523前普、DNMDP、tivozanib壹堰、AZD6482拭卿、BRD-K04800985、PLX-4720贱纠、MK-0752峻厚、MI-1、BRD-K33199242和TG-100-115）（圖Da）和4種PRISM衍生化合物（包括uprosertib谆焊、NVP-BEZ235惠桃、BAY-87-2243和temsirolimus）（圖Ea）。所有這些化合物在高Treg浸潤相關(guān)風險評分組的估計AUC值都較低辖试，并且與Treg浸潤相關(guān)風險評分成反比（圖Db辜王、Eb）。

諾曼圖建立和評估

為了提高上述風險評分的預(yù)測能力罐孝，將風險評分和腫瘤大小結(jié)合起來呐馆，利用多因素cox回歸分析建立了一個諾曼模型（圖A）。1年莲兢、2年汹来、3年和5年的疾病特異性生存（DSS）校正曲線顯示，預(yù)測的生存概率與實際生存率一致改艇，證明了該提名圖在預(yù)測生存方面的穩(wěn)健性（圖A）收班。此外，作者還進行了DCA分析遣耍，結(jié)果顯示諾曼圖的預(yù)后價值優(yōu)于單個變量的預(yù)后價值（圖A）。在訓練集和測試組中炮车，諾曼圖預(yù)測的AUC均超過了風險評分（圖B-E）舵变。

TK1是TNBC的關(guān)鍵風險評分因子和腫瘤促進因子

空間轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示酣溃，TK1陽性表達的細胞主要定位于腫瘤細胞。此外纪隙，在TK1高表達的TNBC組織中赊豌，Treg細胞的浸潤也有所升高（圖A、B）绵咱。為了檢測TK1表達與Tregs之間的關(guān)系碘饼，作者采用Treg標記物FOXP3多重熒光染色法對31例TNBC患者進行了評估。不出所料悲伶，TK1的表達與Treg標記物FOXP3的表達狀態(tài)呈正相關(guān)（圖C-E）艾恼。這一結(jié)果表明，TK1表達較高的患者表現(xiàn)出更多的Treg浸潤麸锉。

隨后作者分析了TCGA泛癌癥隊列中TK1與Hallmark通路之間的關(guān)系钠绍。在多種癌癥類型中，TK1與細胞周期和增殖相關(guān)通路（如MYC靶點和MTORCI信號通路）呈正相關(guān)（圖A）花沉。同時作者分析了TCGA隊列中20種癌癥類型的腫瘤和正常組織中TK1的表達情況柳爽；70%的腫瘤中TK1上調(diào)，包括BLCA碱屁、UCEC磷脯、HNSC、PRAD娩脾、KIRP赵誓、COAD、LUSC晦雨、KIRC架曹、LIHC、BRCA闹瞧、THCA绑雄、LUAD、CHOL奥邮、ESCA和STAD（圖B）万牺。生存分析表明，TK1的高表達與10多種癌癥較差的預(yù)后相關(guān)（圖C）洽腺。

為了驗證TK1在TNBC中作為風險評分的關(guān)鍵角色以及腫瘤啟動子的作用脚粟，作者進行了幾項功能實驗來檢測對照組和siRNA介導(dǎo)敲除組的遷移、侵襲和增殖能力蘸朋。HPA數(shù)據(jù)庫顯示核无，TK1在癌癥組織中高表達（圖A）。為了探索TK1在體外TNBC增殖和遷移中的作用藕坯，研究人員采用瞬時轉(zhuǎn)染靶向TK1的方法抑制其表達（si-TK1-1和si-TK1-2）团南。TK1敲除后噪沙，TNBC細胞的遷移、侵襲和增殖能力下降吐根，差異有統(tǒng)計學意義正歼。與對照組相比，CCK-8（圖D）和集落形成實驗（圖E）結(jié)果顯示拷橘，沉默TK1分別顯著降低了TNBC細胞的活力和增殖能力局义。此外，傷口愈合試驗和Transwell試驗的結(jié)果也顯示冗疮，與對照組相比萄唇，TK1敲除后細胞的遷移能力下降（圖C、F）赌厅∏蠲啵總之，這些發(fā)現(xiàn)共同證實了TK1能促進TNBC細胞的增殖和遷移特愿。

研究總結(jié)：

在這項研究中仲墨，作者證明了TNBC中的Treg浸潤相關(guān)基因可用于建立與臨床相關(guān)的TNBC分類∽嵴希基于三個TNBC隊列目养，開發(fā)并驗證了與Treg浸潤相關(guān)的預(yù)后模型，確定了Treg浸潤相關(guān)基因在腫瘤免疫微環(huán)境的發(fā)展和免疫治療反應(yīng)中的作用毒嫡。此外癌蚁，作者還發(fā)現(xiàn)與Treg浸潤相關(guān)的風險評分呈負相關(guān)且藥物敏感性較高的候選藥物，它們可以預(yù)測TNBC的臨床結(jié)果和免疫治療反應(yīng)兜畸。最終努释，作者通過表型實驗驗證Tregs可能通過調(diào)節(jié)TME內(nèi)TK1的表達來影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后咬摇。最終得出結(jié)論：Treg浸潤相關(guān)預(yù)后模型可以拓寬我們對TNBC生物學和預(yù)后預(yù)測的理解伐蒂，靶向Tregs是治療TNBC的一種很有前景的方法。