A NAC Transcription Factor Represses Putrescine Biosynthesis and Affects Drought Tolerance

這篇文章是2016年12月份發(fā)表在pp上的翎承，關(guān)于枸橘中的一個(gè)與腐胺合成和干旱耐受相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄抑制子侮措。

1. 引言

大量證據(jù)表明，非生物脅迫會(huì)使植物積累各種不同的代謝產(chǎn)物——比如多胺類物質(zhì)，來保護(hù)植物受到這些脅迫相關(guān)的損傷聘惦，從而來適應(yīng)非生物脅迫制市。植物中有三種主要的多胺：腐胺示损、亞精胺和精胺朗和。而本文主要研究的是腐胺。

Fig. 1

高等植物中谊娇，腐胺可由精氨酸經(jīng)精氨酸脫羧酶催化而合成肺孤。腐胺的進(jìn)一步積累，會(huì)使植物更好地適應(yīng)非生物脅迫，比如本文中的干旱耐受渠旁。之前已經(jīng)有很多研究報(bào)道了不同植物中ADC和腐胺在非生物脅迫中的功能攀例，以及調(diào)控ADC的轉(zhuǎn)錄因子。但是顾腊，大部分報(bào)道的都是轉(zhuǎn)錄激活子粤铭，是正調(diào)控ADC和腐胺的合成。而本文發(fā)現(xiàn)的卻是起負(fù)調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄抑制子杂靶，枸橘NAC72梆惯，這也可以說本文的一個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)。

Fig. 2

2. 結(jié)果

然后我們來看一下吗垮，作者是如何展開實(shí)驗(yàn)工作的垛吗。

2.1 Yeast One-Hybrid-Based Screening and Sequence Analysis of PtrNAC72

之前工作已經(jīng)報(bào)道了枸橘ADC基因的功能，于是作者通過酵母單雜技術(shù)烁登，篩選到了位于ADC上游的轉(zhuǎn)錄因子怯屉，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)是NAC家族的，且與擬南芥NAC072序列相似性最高饵沧，就將其命名為PtrNAC72锨络，且發(fā)現(xiàn)N端在不同植物中高度保守，而C端則保守度低狼牺。

Fig. 3

Fig. 4

2.2 Expression of PtrNAC72 in Response to Different Stresses and ABA

接著以一個(gè)月大的枸橘幼苗為材料羡儿，用qRT PCR研究了該轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)冷脅迫、脫水脅迫和ABA時(shí)的相對(duì)表達(dá)水平是钥，說明了確實(shí)是脅迫響應(yīng)基因掠归。

Fig. 5

2.3 PtrNAC72 Functions as a TF and ?also a Transcriptional Repressor of PtADC

然后又以煙草為材料，瞬時(shí)表達(dá)35S-GFP空載和35S-PtrNAC-GFP融合載體悄泥，對(duì)該轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行亞細(xì)胞定位虏冻，結(jié)果表明定位在細(xì)胞核。還進(jìn)一步以酵母為材料弹囚，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性兄旬，且C端對(duì)轉(zhuǎn)錄活性很關(guān)鍵。

Fig. 6

作者進(jìn)一步用酵母實(shí)驗(yàn)和EMSA證明了該轉(zhuǎn)錄因子不僅結(jié)合到ADC基因啟動(dòng)子區(qū)域余寥，而且還是特異性結(jié)合到啟動(dòng)子CACG motif上。轉(zhuǎn)錄因子活性分為兩種悯森，轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制宋舷，為了證明該NAC到底是轉(zhuǎn)錄激活子還是轉(zhuǎn)錄抑制子，作者又利用雙熒光素酶分析和基于GAL4/UAS分析方法同時(shí)表明該轉(zhuǎn)錄因子是ADC基因的轉(zhuǎn)錄抑制子瓢姻。

Fig. 7

2.4 PtrNAC72 Functions to Suppress Putrescine Biosynthesis

為了進(jìn)一步了解該轉(zhuǎn)錄因子的功能祝蝠，作者以過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草28和1-1株系以及鑒定到的純合的擬南芥nac72突變體和構(gòu)建的回復(fù)株系為材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子功能研究，結(jié)果表明绎狭，該轉(zhuǎn)錄因子確實(shí)是負(fù)調(diào)控ADC表達(dá)和腐胺的合成细溅。

Fig. 8

2.5 Drought Tolerance Assay Using PtrNAC72-Overexpressing?Plants and the nac72 Mutant

之前實(shí)驗(yàn)室的工作表明，ADC與干旱耐受相關(guān)儡嘶，因此就猜想增加或者降低NAC72的表達(dá)豐度喇聊，可能會(huì)影響干旱響應(yīng)。于是作者以超表達(dá)煙草株系和擬南芥突變體株系為材料蹦狂，通過表型誓篱、存活率、電解質(zhì)流失率凯楔、MDA含量窜骄、腐胺含量、水分流失速率等指標(biāo)來表明對(duì)干旱的敏感還是耐受摆屯。結(jié)果顯示邻遏，NAC72確實(shí)是在植物響應(yīng)干旱脅迫方面起著負(fù)調(diào)控的作用。

Fig. 9

Fig. 10

Fig. 10

2.6 ROS Accumulation and Antioxidant Enzyme Activities under Drought Stress Conditions

因?yàn)镽OS積累情況也是判斷脅迫耐受程度的一個(gè)重要的指標(biāo)虐骑，于是作者又通過DAB和NBT原位染色技術(shù)准验，分別檢測(cè)了過表達(dá)煙草和擬南芥突變體中過氧化氫和超氧陰離子的含量，同時(shí)也測(cè)定了清除這兩種ROS的抗氧化酶CAT和SOD的活性富弦，結(jié)果表明沟娱，干旱脅迫條件下，NAC72在ROS積累腕柜，抗氧化物酶的活性方面济似，起到負(fù)調(diào)控的作用。

Fig. 11

2.7 Putrescine Levels Correlate with Drought Tolerance in PtrNAC72-Overexpressing Lines and nac72

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明盏缤，擬南芥突變體中腐胺含量明顯高于野生型砰蠢，而過表達(dá)煙草中腐胺含量低于野生型，加之腐胺也是參與脅迫耐受的唉铜，于是作者通過添加ADC抑制劑處理擬南芥和外源添加腐胺處理過表達(dá)煙草台舱，并測(cè)定腐胺含量，觀察表型潭流，水分流失率竞惋，電解質(zhì)流失率，MDA含量及ROS含量等指標(biāo)灰嫉，結(jié)果表明拆宛，腐胺含量確實(shí)與干旱耐受相關(guān)，且含量越高讼撒，越抗旱浑厚。

Fig. 12

Fig. 13

3. 討論

經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)股耽，作者最終確實(shí)是發(fā)現(xiàn)了了負(fù)調(diào)控ADC基因的轉(zhuǎn)錄因子，部分補(bǔ)充完善了ADC調(diào)控網(wǎng)絡(luò)钳幅。但是這些發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子到底是獨(dú)自調(diào)控ADC途徑還是相互之間一起作用來調(diào)控仍然不清楚廉邑。此外催享，作者還發(fā)現(xiàn)捎泻，NAC家族成員能夠識(shí)別的靶基因啟動(dòng)子序列的保守序列模體不僅只有CACG俊抵，還有很多其他保守基序，如GCTT等盖矫，這就可能跟NAC的Binding domain的氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)有關(guān)丽惭，涉及到結(jié)構(gòu)生物學(xué)問題，進(jìn)一步研究可以深入了解NAC家族調(diào)控機(jī)制辈双。最后责掏，還有待解決的問題是，腐胺是通過什么機(jī)制來清除ROS的湃望，是通過抗氧化酶嗎换衬，如果是，潛在的機(jī)制又是什么证芭？仍然需要進(jìn)一步闡明瞳浦。

Fig. 14