轉錄組測序原理

參考：

https://www.bilibili.com/video/BV1XJ411r7bJ/?spm_id_from=333.788.videocard.0

定義

而轉錄組測序即是利用高通量測序技術猪杭，將細胞或組織中的全部或部分mRNA, miRNA, lnc RNA 進行測序分析的技術餐塘。

RNA-seq 應用

通過RNA-seq，也就是轉錄組測序皂吮，可以幫助我們了解各種比較條件下所有基因的表達差異包括：

正常組織與腫瘤組織戒傻；

藥物治療前后的表達差異；

發(fā)育過程中蜂筹，不同發(fā)育階段稠鼻，不同組織的表達差異……

不僅可以檢測，RNA 表達的差異狂票，還有RNA 結構的差異候齿。

轉錄組的主要目的之一便是尋找 基因表達的差異 。

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測序方法（Truseq-RNA）

原始RNA樣本清理

由于獲取的RNA 大部分都是rRNA，只有2%, 3% 是mRNA 及其余的lncRNA, tRNA, miRNA 等慌盯。

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因此主要用于RNA-seq 測定的mRNA 只占了很小的比例周霉。而獲得的大部分的RNA，tRNA 在各個物種和組織中是非常保守的亚皂，如果不是特別測定俱箱，一般不會得到什么有效信息。

RNA 建庫過程

介紹illumina 的Truseq-RNA 建庫方法灭必。

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1）雜交

利用真核生物mRNA 尾部PolyA 修飾的特性狞谱，進行雜交。

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2）打成短序列

將磁珠回收禁漓，也就篩選出了mRNA跟衅，再對這些片段洗脫，并打成短片段播歼。

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3）逆轉錄

將短片段的RNA 進行逆轉錄伶跷，獲得第一鏈cDNA。

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4）合成雙鏈

利用引物合成雙鏈cDNA秘狞。

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5）連接接頭與擴增

到這一步叭莫，就和一般的基因測序一樣了。

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再進行擴增烁试，也就建立了標準的測序文庫雇初。

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接著就可以拿去測序了。

RNA 質量要求

RNA 必須要有比較高質量减响，因為開始的雜交是連接3' 的序列抵皱，因此如果mRNA 發(fā)生了降解，則遠離3' 端的序列就很容易被洗脫掉了辩蛋。

質量檢測

根據(jù)兩個峰的質量進行打分（RIN 值呻畸，最高10分，建議8分以上）悼院，通常來說這兩個峰值越高越尖伤为，打分越高，質量也越高据途。

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數(shù)據(jù)分析

比對

將測序數(shù)據(jù)比對到基因組上绞愚。

質量控制

通常通過檢測比對后的RNA 分布進行判斷。

檢測RNA 片段有多少在3' 位置颖医，又有多少在5' 位置位衩。

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如果左邊顯著不如右邊飽滿，則可能大部分的mRNA 發(fā)生了降解熔萧。

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RPKM值(標準化處理)

具體計算參考：https://www.yuque.com/mugpeng/nwmnq7/cf7lm6

本質上就是一個數(shù)值的標準化處理糖驴。

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差異分析

火山圖對比不同樣本的基因表達量對比僚祷。橫軸反映差異的大小，縱軸反映差異的顯著性贮缕。

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相同差異大小的樣本辙谜，可能由于其樣本統(tǒng)計數(shù)的差異，因而造成了顯著性的差異（置信程度感昼，結果更可信）装哆。

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聚類分析

對基因表達進行分群，可以找出它們的共同或不同特征定嗓。

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富集分析

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可以將差異基因富集到不同功能上蜕琴，探尋它們的功能特性。

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從上到下基因的功能定義越來越精準宵溅，顏色越深凌简，其富集程度越高。

通路分析

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結構變異檢測

建議測序數(shù)據(jù)在10G 以上层玲，以保證測序的覆蓋度号醉。

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可變剪接

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一般人類樣本反症，可以發(fā)現(xiàn)5000～20000個可變剪接辛块。

融合基因

融合基因指，某個基因頭融合到了其他基因的身體上铅碍。

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點突變

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RNA-seq綜述

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