文獻(xiàn)：Ries, R. J., Zaccara, S., Klein, P., Olarerin-George, A., Namkoong, S., Pickering, B. F., ... & Jaffrey, S. R. (2019). m6A enhances the phase separation potential of mRNA. Nature, 571(7765), 424-428.

相關(guān)同類型文獻(xiàn)：
Dynamic m6A methylation facilitates mRNA triaging to stress granules

一、背景知識

Q1. 生物細(xì)胞的相分離是什么物喷？

相分離或者相變（Phase separation）, 描述的是一種細(xì)胞里不同成分間峦失，像液滴一樣尉辑，可以相互碰撞较屿、融合形成液滴隘蝎，從而使一些成分被包裹在液滴內(nèi)嘱么，一些成分被阻隔在液滴外的現(xiàn)象。如P顆粒蛋白几迄，好似油醋汁里的油滴乓旗，劇烈搖晃之后分散成很小的液滴，而后又很快地融合形成大液滴汇跨，這個過程被稱為“液-液相分離”函匕。細(xì)胞內(nèi)的 “相分離”盅惜，形成的液滴可以形成特定環(huán)境加速生物學(xué)反應(yīng)，也可以將不需要的物質(zhì)隔離開结啼。而這種“相分離”的異常郊愧，可能造成疾彩籼（在植物中這種相分離異常會怎樣呢躬翁？）

細(xì)胞內(nèi)的液-液相分離

Q2. 什么是臨界溶解溫度(lower critical solution temperature)?

臨界溶解溫度：是聚合物溶液發(fā)生相分離的臨界溫度例嘱，如果聚合物在某一溫度以下溶解蝶防，而在此溫度以上聚合物溶液出現(xiàn)相分離间学，那么這個溫度就稱為最低臨界溶解溫度(lower critical solution temperature, LCST )印荔；與之相反，如果聚合物在某一溫度以上溶解嘿悬，而在此溫度以下時聚合物溶液發(fā)生相分離善涨，這個溫度則稱為最高臨界溶解溫度(upper critical solution temperature, UCST )

Q3. P-body是什么钢拧？

細(xì)胞質(zhì)加工小體或稱P小體（英文中書寫為Cytoplasmic processing bodies或P-bodies）源内，通過濃縮細(xì)胞質(zhì)中的酶參與mRNA的更新膜钓，同時屏蔽了眾多不需要翻譯的mRNA鏈?zhǔn)顾鼈?strong>遠(yuǎn)離翻譯蛋白颂斜。事實(shí)上焚鲜，P小體是細(xì)胞質(zhì)中不連續(xù)的區(qū)域忿磅，當(dāng)中存在很多參與轉(zhuǎn)錄后過程的細(xì)胞因子撩扒，例如參與mRNA的降解吨些、翻譯的抑制豪墅、mRNA的監(jiān)控和RNA干涉等過程的細(xì)胞因子都可能在P小體中出現(xiàn)斩萌。

摘要：

• 細(xì)胞質(zhì)m6A結(jié)合蛋白-YTHDF1（簡稱DF1）, YTHDF2(簡稱DF2) 和 YTHDF3(簡稱DF3)-在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外發(fā)生“液-液相分離”颊郎；
• 含有多個m6A修飾的mRNA姆吭，顯著加強(qiáng)這種“相分離”内狸；
• 多甲基化的mRNA作為共價支架結(jié)合YTHDF蛋白答倡，將其低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域并置驴党，從而導(dǎo)致相分離倔既。
• 產(chǎn)生的mRNA–YTHDF復(fù)合物分配到不同相分離的區(qū)室中渤涌，例如P-body实蓬，應(yīng)激顆涟仓澹或神經(jīng)元RNA顆粒。m6A-mRNA受到區(qū)室特異性調(diào)控居砖，包括mRNA穩(wěn)定性和翻譯降低奏候。

??也就是說蔗草，當(dāng)mRNAs上存在多個m6A標(biāo)記的時候蕉世，m6A結(jié)合蛋白質(zhì)趨于”黏合”在一起狠轻，（又或稱為螯合作用, 攜帶多個m6A標(biāo)記的mRNAs充當(dāng)一個多化合價“骨架”的角色，使YTHDF蛋白能夠結(jié)合上來谐区，構(gòu)成RNA-蛋白螯合物）昭抒。這種螯合作用接下來會促使細(xì)胞內(nèi)一些液滴狀隔離區(qū)室的形成(m6A表觀修飾所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)“相分離”現(xiàn)象)，將YTHDF蛋白與和它們結(jié)合在一起的mRNAs隔離在區(qū)室內(nèi),如細(xì)胞質(zhì)處理小體 (P-bodies)灭返、應(yīng)激顆粒(stress granules) 或神經(jīng)元RNA顆粒 (neuronal RNA granules) 盗迟。

“我們的研究結(jié)果表明m6A標(biāo)記的一個重要功能是在細(xì)胞應(yīng)激過程中，誘導(dǎo)某些mRNA的儲存熙含。許多這些m6A標(biāo)記的RNA編碼細(xì)胞修復(fù)蛋白罚缕，因此這看起來細(xì)胞修復(fù)過程在應(yīng)激期間以這種方式受到抑制，但是細(xì)胞不再遭受損傷并且適合于啟動修復(fù)時怎静，這種抑制就會被解除邮弹。” by Samie Jaffre

結(jié)果

??朊蛋白結(jié)構(gòu)域(prion-like domains): 朊病毒蛋白（PRION）是生物體正瞅酒福基因編碼的產(chǎn)物腌乡，本不具有感染性和致病性，但是遺傳突變可以產(chǎn)生傳染型朊病毒导饲，可以將正常的朊病毒異構(gòu)為傳染型朊病毒袋毙，其因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)特殊裂七，無法被細(xì)胞內(nèi)溶酶體中的蛋白酶分解徙瓶，而在溶酶體中大量積累壳繁，最終漲破溶酶體，使其中的蛋白酶流出而對細(xì)胞造成破壞昵观，使神經(jīng)細(xì)胞大量死亡而產(chǎn)生海綿狀空洞觉至。瘋牛病纤控、羊瘙癢癥骨田、庫魯病都是由朊病毒引起抵卫。歸根結(jié)底姻采，朊粒是正常寄主的PrP基因編碼的正常蛋白質(zhì)PrP^c 的異構(gòu)體PrP^sc巴刻， 它不是遺傳信息的載體邑雅，不能自我復(fù)制骤星，只是感染動物體內(nèi)正常的PrP^c廊营。
??Prion-like domains (PLDs)，是在與神經(jīng)退行性疾病肌萎縮性側(cè)索硬化癥相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白中發(fā)現(xiàn)的低復(fù)雜性序列蜗巧。即挫鸽，朊蛋白樣結(jié)構(gòu)域（prion-like domains）能夠誘導(dǎo)蛋白發(fā)生相變，相變液滴進(jìn)一步“硬化”會形成病理性的纖維狀聚集惩歉。最近辣恋，PLDs 發(fā)現(xiàn)通過驅(qū)動核糖核蛋白顆粒組裝的液相轉(zhuǎn)變來介導(dǎo)基因調(diào)控稀并。

1. 多甲基化m6A的RNA觸發(fā)DF蛋白液-液相分離

圖1. 多甲基化m6A的RNA觸發(fā)DF蛋白液-液相分離

• a. 緩沖液中，包含DF2重組蛋白的試管中舟舒，當(dāng)溫度從4℃ 加熱到37°C，DF2蛋白發(fā)生相分離食呻，當(dāng)溫度冷卻時(4℃ )仅胞，這種相分離的凝聚效應(yīng)消失；
• b. 當(dāng)溫度以每分鐘1°C的速度升高(22°C至37°C)闹击，可形成蛋白質(zhì)液滴婶熬。而溫度逐漸降低到22°C又會導(dǎo)致液滴分解。
• c. 不同濃度的NaCl條件下芝发，DF2的相變化示意圖。表明鹽會抑制蛋白質(zhì)的相分離潛能苛谷。綠色圓圈表示存在蛋白質(zhì)滴辅鲸；粉色方塊表示在緩沖液中未觀察到蛋白滴。
• d. 免疫染色腹殿，Alexa488–DF2在1分鐘內(nèi)通過熒光顯微鏡成像独悴。
• e. 上圖：光漂白后Alexa488–DF2液滴的熒光強(qiáng)度隨時間的變化曲線。從熒光測量中減去背景锣尉。黑色曲線表示不同液滴中感興趣的光漂白區(qū)域中熒光強(qiáng)度的平均值（n = 8）刻炒；灰色條表示s.e.m.下圖是熒光恢復(fù)的代表性圖像。
• f. 包含10個m6A修飾的RNA(65bp長)誘導(dǎo)DF2迅速形成小液滴自沧，而包含一個m6A修飾或不包含m6A的RNA不會引起DF2相分離坟奥。
• g. 左圖: 添加包含10個m6A位點(diǎn)的RNA增強(qiáng)了溶液中DFs（15μM）的相分離。 右圖：存在和不存在包含10個m6A位點(diǎn)的RNA時拇厢，DF的分配系數(shù)（PC）爱谁。 對于無RNA的條件，在添加含m6A的RNA之前立即計(jì)算分配系數(shù)(右圖：無RNA孝偎，平均PC = 1.0;DF1,n = 8;DF2,n = 10;DF3,n = 9;總計(jì),n = 27)访敌。 在添加包含10個m6A核苷酸的RNA后不久，測量了DF蛋白的分配系數(shù)衣盾，并且平均DF分配系數(shù)顯著增加寺旺。

2. DF蛋白具有液體特征爷抓，并在脅迫時重新定位

圖2. 細(xì)胞中DF蛋白表現(xiàn)出液體特征，并在脅迫條件下重新定位

• a. 42°C熱激30分鐘阻塑，mES細(xì)胞中DF2(紅色)和應(yīng)激顆粒maker TIAR(綠色)進(jìn)行免疫共染色蓝撇。
• b. 亞砷酸鈉（0.5 mM）處理1h,mES細(xì)胞中DF2(紅色)和應(yīng)激顆粒maker TIAR(綠色)進(jìn)行免疫共染色。
• c. 使用CRISPR–Cas9 knock-in 和亞砷酸鹽處理(0.5 mM叮姑，1 h),HEK293細(xì)胞中NeonGreen–DF2的內(nèi)源表達(dá)唉地。NeonGreen–DF2被分配進(jìn)亞砷酸鹽誘導(dǎo)的應(yīng)激顆粒。應(yīng)激顆粒光漂白之后传透，熒光迅速恢復(fù)耘沼，表明NeonGreen–DF2可以在細(xì)胞中活躍地發(fā)生相分離。 線跡表示平均分?jǐn)?shù)熒光
• d. 熱應(yīng)激后(42℃朱盐，30分鐘), mES細(xì)胞中的應(yīng)激顆粒maker DF2（紅色）和P-body maker EDC4（綠色）的共免疫染色發(fā)現(xiàn)P-body與應(yīng)激顆粒非常接近,但不共定位群嗤。

3. m6A增強(qiáng)DF蛋白分配進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)相分離區(qū)室的能力

m6A增強(qiáng)DF蛋白分配進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)相分離區(qū)室的能力

• a. 熱激（42°C，30分鐘）或亞砷酸鹽（0.5 mM兵琳，30分鐘）處理后狂秘，使用應(yīng)激顆粒maker TIAR（綠色）和DF2（紅色）共免疫染色，結(jié)果顯示躯肌，DF2在Mettl14基因敲除的mES細(xì)胞中的重新定位被延遲了者春。
• b. 野生型和Mettl14基因敲除的mES細(xì)胞在應(yīng)激顆粒中的DF2熒光強(qiáng)度比率（TIAR染色的顆粒內(nèi)部的DF2強(qiáng)度/與TIAR染色的顆粒緊鄰的細(xì)胞質(zhì)中的DF2強(qiáng)度）顯示Mettl14敲除細(xì)胞中的DF2共定位延遲。
• c. 熱激（42°C清女，30分鐘）后钱烟，m6A30對應(yīng)激顆粒定位的親和力降低約十倍，DF2突變體(DF2(W432A))中定位收到損害嫡丙。 W432A突變破壞了DF2中結(jié)合m6A的色氨酸籠拴袭。
• d. 野生型mES細(xì)胞中P-bady maker EDC4（綠色）和DF2（紅色）免疫共染色顯示l兩者之間有明確的重疊。但在Mettl14基因敲除細(xì)胞中曙博，這種共定位顯著降低拥刻，DF2看起來更彌散地呈胞質(zhì)狀。

4. 具有m6A修飾mRNA父泳，富集在不同包含DF的RNA顆粒中

具有m6A修飾mRNA般哼，富集在不同包含DF的RNA顆粒中

• a. 從富集不溶性應(yīng)激顆粒部分和總NIH3T3細(xì)胞提取物中，對其ploy(A) RNA的m6A水平惠窄，通過薄層色譜法定量檢測逝她。結(jié)果顯示，在應(yīng)激顆粒中睬捶，m6A水平顯著增加黔宛。
• b. U2OS亞砷酸鹽誘導(dǎo)的應(yīng)激顆粒中mRNA富集的累積分布圖，該圖顯示按每個轉(zhuǎn)錄本注釋的m6A峰數(shù)分類的mRNA。相對于總細(xì)胞RNA臀晃，在應(yīng)激顆粒中觉渴，沒有發(fā)現(xiàn)未甲基化的轉(zhuǎn)錄本。 但徽惋，包含兩個或多個m6A峰的轉(zhuǎn)錄本在應(yīng)激顆粒中富集案淋，并且這種富集與m6A位點(diǎn)的數(shù)量成比例。
• c. 與未甲基化的mRNA相比险绘，含m6A的mRNA在應(yīng)激顆粒中富集度更高踢京。
• d. 缺少m6A注釋位點(diǎn)的兩個mRNA（Grk6和Polr2a), 與長度和豐度相似的含m6A的mRNA匹配（Fignl1和Fem1b，每個包含四個m6A位點(diǎn)）宦棺。 Grk6和Polr2a未富含應(yīng)激顆粒瓣距。 Fignl1和Fem1b在熱激脅迫后的應(yīng)激顆粒中顯著富集，占總smFISH點(diǎn)數(shù)的一部分代咸。
• e. 通過RNA測序確定熱激之前和之后（42°C蹈丸，30分鐘）mRNA表達(dá)水平。對于非甲基化呐芥，單甲基化和多甲基化的m6A-mRNA逻杖，轉(zhuǎn)錄本豐度保持不變。
• f. 通過匹配的核糖體表達(dá)譜和RNA測序數(shù)據(jù)計(jì)算熱激前的翻譯效率思瘟。并且荸百，對處于甲基化狀態(tài)（即在野生型細(xì)胞中）與未甲基化狀態(tài)（即在Mettl14-敲除細(xì)胞）中，每一個mRNA熱激前的翻譯效率進(jìn)行比較滨攻。
• g. 野生型和Mettl14基因敲除的mES細(xì)胞够话，經(jīng)過30分鐘熱激處理(42°C)，然后37°C恢復(fù)1 h的翻譯效率铡买。只有多甲基化的轉(zhuǎn)錄本顯示翻譯效率明顯降低。

實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞霎箍、酶和化學(xué)試劑

HEK 293T/17: 人胚腎細(xì)胞, 293T/17細(xì)胞株是293T細(xì)胞株的衍生株奇钞，293T細(xì)胞進(jìn)行克隆，檢測pBND和pZAP載體漂坏，得到一株能生成高滴度感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生株293T/17細(xì)胞景埃。293T/17細(xì)胞持續(xù)表達(dá)猿病毒40（SV40）大T抗原，而因其高轉(zhuǎn)染能力篩選到17號克隆顶别。

U2OS: 人骨肉瘤細(xì)胞谷徙；U2OS是由Ponten J和Saksela E在1964年從一名15歲女孩的脛骨中等分化的肉瘤中分離建立的。該細(xì)胞表達(dá)胰島素樣生長因子Ⅰ驯绎、Ⅱ（IGF-Ⅰ完慧、IGF-Ⅱ）受體和骨肉瘤衍生生長因子（ODGF）。

NIH3T3: 是由美國國立衛(wèi)生研究院所建立的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系剩失，其特點(diǎn)是每3天傳代一次屈尼，每次接種3×10^5cells/ml册着。 該細(xì)胞系在實(shí)驗(yàn)室常用來做轉(zhuǎn)染及基因表達(dá)的研究。

RNase T1酶
??核糖核酸酶T1為一內(nèi)切核糖核酸酶脾歧。它特異地作用于鳥嘌呤核苷酸(G)3'端磷酸并切割與相鄰核苷酸相連的磷酸二酯鍵甲捏。反應(yīng)的終產(chǎn)物為鳥嘌呤核苷3'磷酸及末端帶鳥嘌呤核苷3'磷酸的寡核苷酸。

嘌呤霉素（Puromycin）
??嘌呤霉素是一種由白黑鏈霉菌產(chǎn)生的氨基苷類抗生素鞭执。其可以打亂核糖體上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)司顿，造成翻譯過程中不成熟鏈終止，從而抑制蛋白質(zhì)合成兄纺。在原核和真核細(xì)胞中大溜，嘌呤霉素都是強(qiáng)效翻譯抑制劑。鏈霉菌中的嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（pac）可使機(jī)體對嘌呤霉素耐藥囤热。嘌呤霉素作用迅速猎提，在低濃度下即可快速導(dǎo)致細(xì)胞死亡。貼壁哺乳細(xì)胞對濃度為2-5 μg/ml的嘌呤霉素較為敏感旁蔼，而懸浮細(xì)胞對濃度低至0.5-2 μg/ml的嘌呤霉素已經(jīng)很敏感锨苏。對嘌呤霉素穩(wěn)定耐藥的哺乳細(xì)胞可在一周內(nèi)生成。
Actinomycin D
（放線菌素D）可濃度依賴性的減少DNA的修復(fù)活性棺聊，IC50值為0.42 μM伞租。Actinomycin D（dactinomycin），actinomycines的成員限佩，是一類從鏈霉菌屬的土壤細(xì)菌中分離的多肽類抗生素葵诈。多年來用作化療劑，actinomycin D與雙鏈和單鏈DNA結(jié)合祟同，通過與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物中的DNA結(jié)合作喘，阻止RNA聚合酶對RNA鏈的延伸，從而抑制DNA和RNA的合成晕城。體外實(shí)驗(yàn)：在原代培養(yǎng)24小時的離體大鼠脂肪細(xì)胞中評估actinomycin D對瘦素釋放的效應(yīng)泞坦，結(jié)果表明，actinomycin D（放線菌素D）和dexamethasone（地塞米松）在24小時的孵育后均減少瘦素mRNA的損失砖顷。對瘦素釋放和瘦素mRNA積累的最大效應(yīng)僅需要0.1 μM的actinomycin D贰锁，而該濃度在24小時的孵育后對脂肪細(xì)胞中18S RNA的含量沒有顯著效果。與瘦素mRNA損失的減少相比滤蝠，在0.1 μM的actinomycin D存在時豌熄，甘油醛-3-磷酸脫氫酶信使核糖核酸（GAPDH mRNA）的損失增加了。這些結(jié)果表明物咳，actinomycin D特異性地調(diào)節(jié)瘦素釋放和瘦素mRNA的水平锣险。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：在大鼠中，actinomycin D對群體峰電位時程的效應(yīng)比對EPSP組件時程的效應(yīng)更顯著，表明對兩種形式的電位具有不同的機(jī)制囱持。而且夯接，通過測量群體峰的幅度，actinomycin D通過海馬和側(cè)腦室注射后可阻止齒狀回中LTP的晚期階段

脅迫處理：

(1) Arsenite stress

亞砷酸鹽：因其能與-SH特異性結(jié)合故能抑制二硫鍵還原酶的活性纷妆，亞砷酸鹽可以引起細(xì)胞應(yīng)激盔几，導(dǎo)致應(yīng)激顆粒的形成。本研究中掩幢，0.5 mM 亞砷酸鈉（Na3AsO3）處理30-60mins 用作亞砷酸鹽脅迫研究逊拍。As有正三價和正五價,即有還原性,也有氧化性.
NaAsO2，(砷離子為+5價际邻，具有氧化性)

(2) Thapsigargin stress

毒胡蘿卜素（Thapsigargin芯丧，TG）：是一種非競爭性，細(xì)胞膜滲透性的SERCAs介導(dǎo)的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（Ca2+-ATPase ）世曾，是一種表征良好的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑缨恒。文章中脅迫處理使用10 μM 處理mES細(xì)胞3 h 或者5 μM處理NIH3T3 細(xì)胞 1.5 h。

免疫染色

實(shí)驗(yàn)過程：細(xì)胞貼壁生長-->收集細(xì)胞-->多聚甲醛固定-->滲透和封閉細(xì)胞-->一抗孵育-->與耦合有熒光的二抗孵育Alexa Fluor 488（綠色）或Alexa Fluor 594（紅色）-->細(xì)胞核使用Hoechst 33342染色（DNA藍(lán)色熒光染料）-->固定劑固定蓋玻片

EDC4: P-body marker
DCP1A:P-body marker
TIAR: stress-granule marker
G3BP1: stress-granule marker
ATXN2: a well- characterized stress granule marker