細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法

一绕娘、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)

1光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

（1）未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小青扔、變形锯七，全面皺縮链快，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象誉己，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體眉尸，凋亡小體為數(shù)個(gè)圓形小體圍繞在細(xì)胞周圍。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮巨双、變圓噪猾、脫落。

（2）染色細(xì)胞：

姬姆薩（Giemsa）染色筑累、瑞氏染色等：正常細(xì)胞核色澤均一袱蜡；凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化慢宗，核膜裂解坪蚁、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)；壞死細(xì)胞染色淺或沒染上顏色镜沽。

蘇木素-伊紅（HE）染色：細(xì)胞核固縮碎裂敏晤、呈藍(lán)黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細(xì)胞）缅茉，正常細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色嘴脾，壞死細(xì)胞核呈很淡的藍(lán)色或藍(lán)色消失。

2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況蔬墩。

常用的DNA特異性染料有：Hoechst?33342译打，Hoechst?33258，DAPI拇颅。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的奏司，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光樟插。

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料韵洋，能進(jìn)入正常細(xì)胞膜而對(duì)細(xì)胞沒有太大細(xì)胞毒作用哥谷。Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高。

DAPI為半通透性麻献，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色们妥。

PI和Hoechst33342雙標(biāo)：PI、Hoechst33342均可與細(xì)胞核DNA（或RNA）結(jié)合勉吻。但PI不能通過正常細(xì)胞膜监婶，Hoechst則為膜通透性熒光染料，故細(xì)胞在處于壞死或晚期調(diào)亡時(shí)細(xì)胞膜被破壞齿桃，這時(shí)可為PI著紅色惑惶。正常細(xì)胞和中早期調(diào)亡細(xì)胞均可被Hoechst著色，但是正常細(xì)胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形短纵，淡蘭色带污，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而調(diào)亡細(xì)胞的核由于濃集而呈亮蘭色香到，或核呈分葉鱼冀，碎片狀，邊集悠就。故PI著色為壞死細(xì)胞千绪；亮蘭色，或核呈分葉狀梗脾，邊集的Hoechst著色的為調(diào)亡細(xì)胞荸型。

凋亡細(xì)胞體積變小挡逼，細(xì)胞質(zhì)濃縮衬廷。細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased）笛坦，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)吠各；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚对粪、邊緣化浙踢；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊冲泥，產(chǎn)生凋亡小體(圖1)氧猬。

3透射電子顯微鏡觀察

凋亡細(xì)胞體積變小妈嘹，細(xì)胞質(zhì)濃縮柳琢。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis?nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)润脸；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚柬脸、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期毙驯，細(xì)胞核裂解為碎塊倒堕，產(chǎn)生凋亡小體。

二爆价、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)垦巴，但在細(xì)胞凋亡早期媳搪，PS可從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中骤宣。磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)位發(fā)生在凋亡早期階段秦爆，先于細(xì)胞核的改變、DNA斷裂憔披、細(xì)胞膜起泡等限。體內(nèi)的吞噬細(xì)胞可通過識(shí)別磷脂酰絲氨酸來清除凋亡細(xì)胞。Annexin-V（green）是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白芬膝，能與PS高親和力特異性結(jié)合望门，細(xì)胞處于調(diào)亡或壞死時(shí)，Annexin-V可為陽性（早期壞死細(xì)胞可能為陰性）锰霜，是檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)筹误。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記癣缅，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針厨剪，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

PI和Annexin-V雙標(biāo)：

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料所灸，它不能透過完整的細(xì)胞膜丽惶，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞炫七，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染爬立。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來万哪。*注意：細(xì)胞凋亡時(shí)其DNA可染性降低被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞標(biāo)志之一侠驯，但這種DNA可染性降低也可能是因?yàn)镈NA含量的降低，或者是因?yàn)镈NA結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致奕巍。在分析結(jié)果時(shí)應(yīng)該注意吟策。

活細(xì)胞不能被AnnexinV-FITC或PI染色（右圖左下象限）。早期凋亡細(xì)胞因磷脂酰絲氨酸的暴露及具有完整細(xì)胞膜的止，故呈AnnexinV-FITC染色陽性及PI染色陰性（右圖右下象限）檩坚。壞死或晚期凋亡的細(xì)胞呈AnnexinV-FITC及PI染色雙陽性（右圖右上象限）。

*注意：未處理的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)的過程中也有一小部分的細(xì)胞死亡發(fā)生诅福。

三匾委、線粒體膜電位的檢測(cè)

線粒體跨膜電位下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件氓润，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮赂乐、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰咖气，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)挨措。線粒體跨膜電位的存在挖滤，使一些親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低浅役。

名稱檢測(cè)原理

3斩松，3’-Dihexyloxacarbocyanine iodide

（DiOC6）

一種有細(xì)胞通透性及電壓敏感性的親脂性陽離子熒光染料，用作膜電位探針觉既，能選擇性地染線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

3砸民，3’-Dihexyloxadicarbocyanine iodide一種有細(xì)胞通透性及電壓敏感性的親脂性陽離子熒光染料，能識(shí)別發(fā)卡四重結(jié)構(gòu)奋救。也用作端粒酶抑制劑及抗癌試劑岭参，能在活細(xì)胞特異地染色線粒體，用于線粒體定位及鑒定其氧化能力

Rhodamine 123一種能染活細(xì)胞線粒體的有膜通透性的熒光染料尝艘，廣泛用于測(cè)定線粒體膜電位演侯，能用于檢測(cè)耐藥的腫瘤細(xì)胞的P-糖蛋白的流出活性。

JC-1一種陽離子染料背亥，用作線粒體膜電位的指示劑

注意事項(xiàng)

1． 始終保持平衡染液中pH值的一致性秒际，因?yàn)閜H值的變化將影響膜電位。

2． 與染料達(dá)到平衡的細(xì)胞懸液中如果含有蛋白狡汉，他們將與部分染料結(jié)合娄徊，降低染料的濃度，引起假去極化盾戴。

四寄锐、DNA片斷化檢測(cè)

細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成50~300kbp長(zhǎng)的DNA大片段,或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細(xì)胞經(jīng)處理后尖啡，采用常規(guī)方法分離提純DNA橄仆，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder衅斩。如果細(xì)胞量很少盆顾，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記畏梆，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影您宪，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成。

1.大分子染色體DNA片段的測(cè)定

細(xì)胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長(zhǎng)的DNA大片段奠涌。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同宪巨。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時(shí)，即達(dá)到分辨力的極限铣猩。此時(shí)凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA揖铜，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場(chǎng)一極而通過凝膠达皿，這種遷移模式稱之為"爬行"天吓。因此贿肩，細(xì)胞凋亡早期產(chǎn)生的50~300kbp長(zhǎng)的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問題龄寞。這個(gè)方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場(chǎng)汰规。每當(dāng)電場(chǎng)方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中物邑，直至新的電場(chǎng)軸向重新定向后溜哮，才能繼續(xù)向前移動(dòng)。DNA分子量越大色解，這種重排所需要的時(shí)間就越長(zhǎng)茂嗓。當(dāng)DNA分子變換方向的時(shí)間小于電脈沖周期時(shí)，DNA就可以按其分子量大小分開科阎。

2.DNA Ladder測(cè)定

3.凋亡細(xì)胞DNA含量的流式細(xì)胞計(jì)分析

4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)

優(yōu)點(diǎn)：敏感度高述吸，適合于檢測(cè)少量樣本，小部分凋亡細(xì)胞锣笨。如臨床活組織檢測(cè)蝌矛。

五TUNEL法

細(xì)胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下將脫氧核糖核苷酸和熒光素错英、過氧化物酶入撒、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)椭岩，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）茅逮。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成簿煌，很少能夠被染色氮唯。TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色姨伟，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片豆励、冰凍組織切片夺荒、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測(cè)定，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞良蒸，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用技扼。

六、Caspase-3活性的檢測(cè)

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用嫩痰，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子剿吻，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中串纺，在凋亡的早期階段丽旅，它被激活椰棘，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物榄笙，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡邪狞。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降茅撞。

1 Western blot分析Procaspase-3的活化帆卓，以及活化的Caspase-3及對(duì)底物多聚ADP-核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解米丘。

2熒光分光光度計(jì)分析

原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物剑令，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點(diǎn)拄查，設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC尚洽。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AMC不能被激發(fā)熒光靶累，短肽被水解后釋放出AMC腺毫，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小挣柬，可以測(cè)定caspase-3的活性潮酒，從而反映Caspase-3被活化的程度。

3流式細(xì)胞術(shù)分析

方法：收獲細(xì)胞正承盎祝或凋亡細(xì)胞?PBS洗滌急黎，加Ac-DEVD-AMC 37°C反應(yīng)1h UV流式細(xì)胞計(jì)分析caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度。

七侧到、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析

TFAR19（PDCD5）勃教，前期的功能研究表明，它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑匠抗。利用熒光素（FITC）標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針故源，對(duì)細(xì)胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象汞贸，伴隨著細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化绳军，持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，在凋亡小體中仍然可見矢腻。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)门驾，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細(xì)胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一多柑。進(jìn)一步的研究證明奶是，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。

方法：

1懸浮細(xì)胞的染色：（1）收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞（0.5~1′106）聂沙，PBS洗2次秆麸，1000rpm′10min。（2）3%多聚甲醛冰浴10min逐纬，PBS洗2次蛔屹，1000rpm′10min。（3）加入PBS-T溶液豁生，37°C孵育15min兔毒，PBS洗2次，1000rpm′10min甸箱。（4）加入200ml胎牛血清育叁，室溫反應(yīng)30min。（5）加入5ml FITC標(biāo)記的TFAR19單抗（終濃度為1：40）芍殖，4°C反應(yīng)30min（6）熒光細(xì)胞洗液洗2次豪嗽，1000rpm 10min。結(jié)果觀察：將細(xì)胞沉淀滴片豌骏，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位龟梦。同時(shí)用流式細(xì)胞計(jì)定量檢測(cè)TFAR19蛋白的平均熒光強(qiáng)度。

2：貼壁細(xì)胞的原位染色（1） 貼壁生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期細(xì)胞鋪在24孔或6孔板中（內(nèi)有潔凈蓋玻片）窃躲，讓其爬片生長(zhǎng)计贰，待長(zhǎng)到50%~80%滿時(shí)，凋亡誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞蒂窒。（2）將不同時(shí)間點(diǎn)處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色躁倒，染色步驟同上。（3）將染色的爬片細(xì)胞放于一張滴有少量甘油（5ml）的載玻片上洒琢，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位秧秉。結(jié)果觀察