今天的筆記是關(guān)于另一種RNA測(cè)序的方法，稱為T(mén)T-seq臼疫。其實(shí)這些測(cè)序方法在幾年前被人們所使用了扣孟，但是因?yàn)樽约翰⒉涣私膺@些知識(shí)烫堤，所以要慢慢的補(bǔ)起來(lái)凤价。
文獻(xiàn)題目：TT-seq maps the human transient transcriptome
發(fā)表時(shí)間：2016
雜志：Science
摘要
基因組的普遍轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生穩(wěn)定的和不穩(wěn)定的RNA（瞬時(shí)的）。作者開(kāi)發(fā)了一種瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（TT-seq）利诺，這個(gè)方法可以估測(cè)RNA合成和降解的速率。使用TT-seq對(duì)人類K562細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序立轧，除了復(fù)原了穩(wěn)定的mRNA和長(zhǎng)非編碼RNA的map以外，還繪制了瞬時(shí)增強(qiáng)子氛改、反義RNA和啟動(dòng)子相關(guān)的RNA。TT-seq分析顯示增強(qiáng)子RNA壽命短胜卤，缺乏U1基序（motif）和二級(jí)結(jié)構(gòu)。TT-seq還能繪制短暫RNA下游的聚腺苷酸化位點(diǎn)葛躏，并揭示轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。作者發(fā)現(xiàn)败富，平均四個(gè)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)分布在平均寬度為~3300個(gè)堿基對(duì)的window中。終止位點(diǎn)與一種與RNA聚合酶暫停相關(guān)的motif一致兽叮。
正文
真核基因組的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生蛋白質(zhì)編碼mRNA和多種非編碼RNA（ncRNAs）芬骄，包括eRNA鹦聪。大部分的ncRNA會(huì)非常快速的被降解泽本，因此不能完全的對(duì)它們進(jìn)行map。然而對(duì)于瞬時(shí)RNA的繪制圖譜對(duì)于分析RNA序列规丽、功能和“命運(yùn)”是非常有必要的。
作者開(kāi)發(fā)了瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序（TT-seq）嘁捷，這個(gè)方法繪制轉(zhuǎn)錄的活性區(qū)域，可以估測(cè)RNA合成和降解速率。TT-seq是基于4sU-seq的一項(xiàng)技術(shù)喘蟆，將細(xì)胞暴露在核苷類似物4-硫尿核苷中（4sU）（圖1A）。4sU在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中被整合到RNA上蕴轨，被標(biāo)記有4sU的RNA被分離出來(lái)并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。4sU-seq比RNA-seq更加靈敏橙弱，可以測(cè)到瞬時(shí)RNA。然而棘脐，4sU不能很好的map到人類轉(zhuǎn)錄本上，因?yàn)橹挥行律D(zhuǎn)錄本的3’端才可以在4sU暴露期間被標(biāo)記上蛀缝，而提前已經(jīng)存在的5’端區(qū)域則優(yōu)先被測(cè)序。為了去掉這個(gè)5'端的bias屈梁，TT-seq在分離被標(biāo)記的RNA之前先將RNA片段化（圖1A）。因此在讶，TT-seq方法只測(cè)定哪些最新被轉(zhuǎn)錄的RNA片段，提供了聚合酶在基因組上5分鐘內(nèi)的轉(zhuǎn)錄位置革答。
當(dāng)使用人類K562細(xì)胞時(shí)，TT-seq樣品新轉(zhuǎn)錄區(qū)域是唯一的蝗碎，而4sU-seq產(chǎn)生5'bias（圖S1A）。在TT-seq測(cè)序中蹦骑，短壽命的內(nèi)含子的覆蓋率大概有60%，而在4sU-seq和RNA-seq中分別只有23%和8%（圖S1A和S2）眠菇。TT-seq是高度可重現(xiàn)的，可完整的mapping轉(zhuǎn)錄區(qū)域捎废，彌補(bǔ)GRO-cap和CAGE的方法，后二者檢測(cè)的是RNA的5’端（圖1B）登疗。TT-seq可監(jiān)測(cè)RNA合成，而PRO-seq, NET-seq和mNET-seq檢測(cè)的是RNA與聚合酶的結(jié)合辐益。因此，后面幾種的方法產(chǎn)生的信號(hào)峰在啟動(dòng)子附近（聚合酶停留的地方）（圖1B）智政，而TT-seq的峰并不是。對(duì)于暫停和激活基因续捂，TT-seq更能揭示RNA在啟動(dòng)子相關(guān)的其他區(qū)域上RNA的合成（圖S1B）。
利用TT-seq數(shù)據(jù)和分割算法GenoSTAN，作者確定了21,874個(gè)明顯非間斷的基因組間隔轉(zhuǎn)錄(轉(zhuǎn)錄單位萍肆，TUs)(圖2和圖S4A)。TT-seq高度敏感匾鸥，可復(fù)原GRO-cap的65%的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSSs)。共有8543個(gè)TUs與GENCODE注釋在正義方向的轉(zhuǎn)錄重疊。該分析檢測(cè)到7810個(gè)mRNA, 302個(gè)長(zhǎng)非編碼RNA (lincRNAs)和431個(gè)反義RNA(asRNA)馏艾。與編碼注釋共享長(zhǎng)度不到50%的2916個(gè)TUs未被分類。剩下的10415(48%)代表了作者新鑒定的ncRNA琅摩。
轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物來(lái)自啟動(dòng)子，也來(lái)自增強(qiáng)子房资，增強(qiáng)子是具有特征染色質(zhì)修飾的調(diào)控元件。為了檢測(cè)包含潛在的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的染色質(zhì)區(qū)域轰异，作者使用GenoSTAN算法對(duì)共激活因子p300和一系列組蛋白修飾(H3K27me3、H3K36me3搭独、H4K20me1、H3K4me1牙肝、H3K4me3嗤朴、H3K9ac和H3K27ac)的 ENCODE ChIP-seq(染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序)數(shù)據(jù)分析虫溜，并對(duì)脫氧核糖核酸酶I超敏數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(圖S5A)雹姊。在強(qiáng)增強(qiáng)子狀態(tài)的區(qū)域中衡楞，81%與至少一個(gè)TSS（從GRO-cap）和68%與聚合酶Pol II的峰重疊(圖S5, B到D)。
TT-seq的動(dòng)態(tài)模型和RNA-seq 數(shù)據(jù)使我們可以估測(cè)RNA合成的降解的速率（圖3和圖S7）。作者估算在每一個(gè)轉(zhuǎn)錄位置上磷酸二酯鍵的形成和斷裂行瑞，并在TUs內(nèi)把這些平均盖文，因此獲得相對(duì)的轉(zhuǎn)錄速率和RNA的穩(wěn)定性。作者發(fā)現(xiàn)mRNA和lincRNAs有著最高的合成速率和最長(zhǎng)的半衰期轴总。mRNA的平均半衰期是50分鐘氧吐。其他類型的轉(zhuǎn)錄本合成速率比較低末盔，半衰期也更短筑舅。這就解釋了為什么ncRNA非常難以檢測(cè)庄岖。eRNA的半衰期只有幾分鐘豁翎。短的RNA半衰期也伴隨著缺少二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖S7）。eRNA的折疊能量與其他RNA相比心剥，它們的序列只有10%是具有結(jié)構(gòu)的邦尊。
TT-seq還可以讓我們能夠發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)(TTSs)优烧。TT-seq檢測(cè)了瞬時(shí)RNA下游的聚腺苷酸化(pA)位點(diǎn)(圖S9)。
這種RNA由于RNA在pA位點(diǎn)裂解而難以檢測(cè)又沾，導(dǎo)致無(wú)保護(hù)的5 '端和外切酶降解RNA≌人ⅲ總共6977個(gè)mRNA基因里作者平均得到4個(gè)TTSs，TTS是位于一個(gè)終端window滑燃，從最后一個(gè)pA位點(diǎn)延伸，直到最終的TTS表窘，在最終的TTS處，RNA覆蓋率會(huì)降到背景水平(圖4,a到C)甜滨。終止窗口的平均寬度3300 bp，最寬可達(dá)10kb寬（圖S10）衣摩，與Pol II占用位置是一致的數(shù)據(jù)(圖4 d)，說(shuō)明Pol II在TTS處暫停艾扮。
沒(méi)有對(duì)該文獻(xiàn)進(jìn)行全文翻譯栏渺，只是翻譯了一些我覺(jué)得應(yīng)該了解的內(nèi)容。有興趣的同學(xué)可以自行下載原文閱讀~
