一、什么是原位雜交细卧？
原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)，簡(jiǎn)稱(chēng)原位雜交（In Situ Hybridization，ISH）秒咨，它是運(yùn)用已知堿基序列并帶有標(biāo)記物的核酸探針與組織細(xì)胞中待測(cè)的核酸按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體掌挚，然后再運(yùn)用與標(biāo)記物相應(yīng)的顯示或檢測(cè)系統(tǒng)雨席，通過(guò)組織化學(xué)或免疫細(xì)胞化學(xué)等方法在核酸原有的位置進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)核酸（DNA、RNA）定位的一種檢測(cè)技術(shù)吠式。
目前陡厘，原位雜交技術(shù)在基因分析和診斷方面能作定性抽米、定位和定量分析，已成為最有效的分子病理學(xué)技術(shù)糙置，同時(shí)在分析低豐度和罕見(jiàn)的mRNA表達(dá)方面展示了分子生物學(xué)的一重要方向云茸。
二、原位雜交的分類(lèi)
根據(jù)所用探針和靶核酸的不同谤饭，原位雜交可分為DNA-DNA雜交查辩，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類(lèi)，其穩(wěn)定性依次增大网持。
根據(jù)探針的標(biāo)記物是否具有放射性宜岛，原位雜交又可分為同位素標(biāo)記探針?lè)ê头峭凰貥?biāo)記探針?lè)▋深?lèi)。同位素標(biāo)記探針?lè)ㄊ怯梅派湫酝凰貥?biāo)記探針與靶核酸進(jìn)行雜交功舀，雜交后可用敏感性高的放射自顯影技術(shù)檢測(cè)萍倡。常用的放射性同位素如3H、32P辟汰、35S列敲、125I等。非同位素標(biāo)記探針?lè)ㄒ话阌冒肟乖瓨?biāo)記探針帖汞，如生物素（Biotin）戴而、地高辛素（DIG）等，最后通過(guò)免疫組織化學(xué)法對(duì)半抗原定位翩蘸，間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體所意。
原位雜交最初是以同位素標(biāo)記探針進(jìn)行的，這種方法敏感性高催首，但核素具有半衰期限制扶踊、放射性污染且該方法成本高、耗時(shí)長(zhǎng)郎任，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員具有輻射危害秧耗。而非同位素標(biāo)記探針雖然在敏感性方面不如同位素標(biāo)記探針，但其穩(wěn)定性和分辨力高舶治，檢測(cè)時(shí)間短分井，一般在24h即可得到結(jié)果，同時(shí)操作簡(jiǎn)便霉猛，沒(méi)有放射性污染的安全問(wèn)題尺锚。因此，非同位素標(biāo)記探針(尤其是生物素標(biāo)記探針和地高辛標(biāo)記探針)迅速發(fā)展韩脏，逐漸成為原位雜交技術(shù)的主流方法缩麸，更受科技工作者的關(guān)注與青睞铸磅。
三赡矢、原位雜交選擇指南
1杭朱、生物素標(biāo)記探針or地高辛標(biāo)記探針?
地高辛標(biāo)記技術(shù)源于一種從洋地黃類(lèi)植物中提取的類(lèi)固醇物質(zhì)——Digoxigenin（DIG）。由于Digoxigenin在自然界中來(lái)源單一吹散，因此抗DIG的抗體不會(huì)與其他的生物物質(zhì)結(jié)合弧械，從而可以滿(mǎn)足特異性標(biāo)記的需要。同樣是小分子標(biāo)記物空民，生物素廣泛存在于各種組織中刃唐，對(duì)于靈敏度很高的標(biāo)記檢測(cè)實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，樣品自身含有的內(nèi)源生物素界轩，就會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾画饥。地高辛就能夠很好地避免這個(gè)問(wèn)題。
2浊猾、PCR法or隨機(jī)引物法?
如果有足夠量的高純度模板抖甘，可以采用隨機(jī)引物標(biāo)記方法。而當(dāng)只能獲得有限量模板葫慎，或模板僅僅部分純化衔彻，或模板非常短時(shí)，PCR標(biāo)記是制備DIG標(biāo)記探針的優(yōu)選方法偷办。它比其他方法需要更少的優(yōu)化艰额，且標(biāo)記探針產(chǎn)量高。在PCR標(biāo)記過(guò)程中椒涯，熱穩(wěn)定聚合酶會(huì)在擴(kuò)增模板DNA特定區(qū)域時(shí)結(jié)合DIG-dUTP柄沮。其生成的是高度標(biāo)記、非常特異废岂、且非常敏感的雜交探針铡溪。
市場(chǎng)上主要使用隨機(jī)引物法的試劑盒如羅氏的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 和II，標(biāo)記效率較高泪喊；主要使用PCR法的試劑盒如常州百代生物的BIOG地高辛標(biāo)記試劑盒棕硫，盒內(nèi)特別的采用了超級(jí)熱啟動(dòng)Taq酶，大幅提升了探針的雜交活性袒啼，與隨機(jī)引物法相比哈扮，具有非常顯著的性能優(yōu)勢(shì)，可以通過(guò)雜交檢測(cè)到極低拷貝甚至是單拷貝基因蚓再。
3滑肉、地高辛標(biāo)記的探針免疫酶學(xué)檢測(cè)方法Dig –HRP or Dig –AKP？
常用的免疫酶學(xué)檢測(cè)方法有兩類(lèi)：
·Dig –HRP（辣根過(guò)氧化物酶）檢測(cè)體系：以DAB（四氫氯化二氨基聯(lián)苯胺）/H2O2為底物摘仅，結(jié)果為棕色靶庙；或以4-氯-1-萘酚/H2O2為底物，結(jié)果為藍(lán)色娃属。
·Dig –AKP（堿性磷酸酶）檢測(cè)體系：以BCIP/NBT為底物六荒，結(jié)果為藍(lán)紫色沉淀护姆。
與免疫細(xì)胞化學(xué)方法相似，如應(yīng)用酶促反應(yīng)會(huì)較單一信號(hào)的標(biāo)記物如熒光素具有更高的靈敏度掏击。同樣是酶促化學(xué)反應(yīng)卵皂，AKP靈敏度和分辨率較HRP高約10倍左右。以BIOG地高辛標(biāo)記探針原位雜交檢測(cè)小鼠肝臟組織漢坦病毒感染為例（圖1）砚亭，以堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體灯变，與組織細(xì)胞中通過(guò)原位雜交定位結(jié)合的地高辛標(biāo)記探針高效結(jié)合，再通過(guò)NBT/BCIP顯色捅膘，即可靈敏準(zhǔn)確地展示出所要檢測(cè)的靶基因及其細(xì)胞定位添祸，可廣泛用于組織原位雜交、細(xì)胞原位雜交和染色體原位雜交等寻仗。
