多肽是由氨基酸縮合連接而成的具有一定生物活性的化合物备燃，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景碉克。多肽藥物是現(xiàn)代醫(yī)藥研究的前沿方向，具有重要的社會價值和經(jīng)濟價值并齐。綜述了多肽生物合成法（天然原料提取法漏麦、酶解法、發(fā)酵法况褪、基因重組法）和化學合成方法（液相合成法和固相合成法）的研究進展撕贞，重點綜述化學合成法中的固相多肽合成工藝，介紹了反相高效液相色譜法测垛、毛細管電泳法捏膨、離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法、親和層析法在多肽分離純化中的應(yīng)用情況号涯，最后對多肽制藥技術(shù)的未來發(fā)展進行展望目胡。
關(guān)鍵詞：多肽；藥物链快；合成誉己；純化
多肽是由氨基酸縮合連接而成的，具有一定生物活性的化合物分子域蜗。相對于蛋白質(zhì)物質(zhì)巨双，空間結(jié)構(gòu)較為簡單、穩(wěn)定性較高霉祸，且具有較低的免疫原性筑累。可作用于皮膚系統(tǒng)脉执、肌肉骨骼系統(tǒng)、血液系統(tǒng)戒劫、心血管系統(tǒng)半夷、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等迅细。隨著生物技術(shù)巫橄、合成技術(shù)及分析技術(shù)的快速發(fā)展，多肽已成為一個重要的生命科學研究領(lǐng)域茵典。如今多肽產(chǎn)品已在醫(yī)療湘换、保健食品、化妝品统阿、新材料等眾多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用彩倚，尤其是在醫(yī)藥領(lǐng)域，多肽藥物正發(fā)揮越來越重要的作用[1]扶平。
多肽藥物是指通過生物合成法或者化學合成法獲得的具有特定治療作用的多肽帆离，廣泛應(yīng)用于疫苗[2]、抗腫瘤[3]结澄、抗菌[4]哥谷、內(nèi)分泌、心血管等醫(yī)療領(lǐng)域麻献，具有副作用小们妥、特異性強、效果顯著勉吻、生物活性高监婶、用藥劑量少、不易產(chǎn)生耐藥性等諸多優(yōu)點齿桃，但也存在半衰期短[5]压储、不穩(wěn)定鲜漩、易降解、口服吸收率低等不足集惋。雖然多肽作為藥物的開發(fā)史較短孕似，但相對于小分子藥物及蛋白質(zhì)藥物有其獨特的優(yōu)勢，低毒性刮刑、原料易得喉祭、較易合成、產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢明顯雷绢，因此發(fā)展十分迅速泛烙，目前已成為市場開發(fā)的全新增長點，具有重要的社會價值和經(jīng)濟價值翘紊。目前已上市的多肽藥物達到近100 種[6]蔽氨，例如用于多發(fā)性硬化的格拉替雷[7]；用于糖尿病的利拉魯肽帆疟、艾塞那肽[8]鹉究；用于前列腺癌的亮丙瑞林[9]、曲普瑞林[10]踪宠；用于骨質(zhì)疏松的鮭降鈣素自赔、特立帕肽[11]；用于胰腺炎的奧曲肽[12]柳琢；用于冠心病的依替巴肽绍妨、比伐盧定[13]。其中不少是年銷售超過數(shù)億美元甚至數(shù)十億美元的產(chǎn)品[1]柬脸。而正在開展臨床試驗研究的多肽藥物約140 種[14]他去。
由于多肽藥物的生物活性和獨特的優(yōu)勢，多肽藥物制備工藝的研究已經(jīng)成為當前研究的前沿與熱點倒堕。而多肽的合成及純化方法是多肽制藥工藝的重要組成部分孤页，本文主要從合成、純化兩個方面對多肽制藥工藝的研究進展進行綜述涩馆。多肽合成方法主要有生物合成法和化學合成法行施，本文重點介紹了固相多肽合成法的工藝研究進展。對于多肽分離純化工藝研究進展魂那，則從反相高效液相色譜法蛾号、毛細管電泳法、離子交換色譜法涯雅、凝膠過濾色譜法鲜结、親和層析法等幾個方面進行簡要介紹。最后從專業(yè)出發(fā)結(jié)合環(huán)境友好對多肽藥物制備技術(shù)未來發(fā)展進行一些思考與展望。
1 多肽合成方法
20 世紀初肽類物質(zhì)首次被合成[15]精刷。20 世紀50年代美國科學家du Vigneaud 等[16]合成第一種多肽——催產(chǎn)素[16]拗胜。幾十年來多肽合成發(fā)展迅速，目前多肽合成方法（表1怒允、圖1）可分為生物合成法及化學合成法埂软。隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展，多肽生物合成法除了傳統(tǒng)的天然提取法纫事，常用的酶解法勘畔、發(fā)酵法外，基因重組法也在多肽合成中得到了逐步應(yīng)用丽惶。多肽化學合成法利用保護基團保護原料氨基酸中暫不反應(yīng)的基團炫七，保證反應(yīng)按照設(shè)計方向進行，通過氨基酸之間的縮合反應(yīng)來實現(xiàn)氨基酸連接延長钾唬，以獲得特定序列的多肽阱持。多肽化學合成法有液相合成法與固相合成法骑脱，兩者主要的區(qū)別源于是否使用固相載體沉颂。
1.1 生物合成法
生物合成法可分為天然提取法砖第、酶解法骡和、發(fā)酵法囤热、基因重組法等炸枣。
1.1.1 天然提取法 天然提取法是從生物組織中提取多肽物質(zhì)搭伤。先將組織細胞破碎踊挠，再通過超聲提取乍桂、化學試劑提取等物理化學方法進行提取。Wang等[18]先將中國林蛙干皮在固液比1∶15 的6%乙酸溶液中15℃下浸泡5 min效床，超聲提取1 h睹酌，后經(jīng)過旋蒸、離心獲得多肽提取物RCP剩檀，測得樣品蛋白質(zhì)含量6.313 g/L憋沿。Gasu 等[19]利用物理、化學方法從海洋軟體動物Olivancillaria Hiatula中提取重組多肽沪猴。所得多肽提取物具有廣譜抗菌活性辐啄，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有抑制作用。然而运嗜，這一技術(shù)受限于天然原料壶辜，產(chǎn)量有限，且僅有天然多肽體系担租，存在純化難度較高砸民、在臨床運用中可能導致病人產(chǎn)生過敏反應(yīng)[20]等問題。此外部分物理化學法可能會導致多肽降解或造成后續(xù)研究的不便，因此研究者們不斷探索嘗試更溫和高效的方法岭参。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 表1 多肽合成方法［17］
1.1.2 酶解法 酶解法利用生物酶將蛋白質(zhì)降解獲得多肽反惕。Wu 等[21]利用堿性蛋白酶水解甜高粱籽粒蛋白，得到一種新型ACE 抑制肽演侯，并建立了酶解過程的動力學模型姿染。相對于物理或化學提取方法，酶解法具有反應(yīng)條件溫和蚌本、選擇性高等優(yōu)勢盔粹，但也存在投入大產(chǎn)量低、酶解得到的一系列多肽分離純化難度大等不足[22]程癌，此外特定酶解位點的蛋白酶也需要進行篩選舷嗡。龐大的蛋白質(zhì)加工行業(yè)產(chǎn)生了大量的下腳料及廢棄物，蘊含豐富的蛋白質(zhì)資源嵌莉，如何提高這些資源的利用效率值得思考进萄。Wang 等[23]利用7 種蛋白酶從海參廢液中提取多肽，發(fā)現(xiàn)復合蛋白酶效果最佳锐峭。并對酶解條件進行了優(yōu)化中鼠，最佳酶解條件為：酶用量647 u/g，pH6.48沿癞，溫度52.5℃援雇，酶解時間3.44 h，最佳條件下蛋白質(zhì)水解度25.9%椎扬。利用酶解法進行蛋白質(zhì)深加工提供了一個可能的提高蛋白質(zhì)利用率和價值的思路惫搏，而進一步提高產(chǎn)率決定了能否將其推向產(chǎn)業(yè)化。由于多肽藥物對質(zhì)量控制有嚴格要求蚕涤，對起始物料亦有規(guī)定筐赔，而酶解法主要得到多肽混合物，故現(xiàn)階段更適用于食品揖铜、化妝品茴丰、飼料等行業(yè)的多肽需求。
1.1.3 發(fā)酵法 發(fā)酵法是利用微生物代謝發(fā)酵生產(chǎn)多肽天吓，成本低贿肩，但分離純化難度較大。尹樂斌等[24]通過乳酸菌發(fā)酵豆清液制備大豆活性多肽龄寞，并進行工藝優(yōu)化調(diào)整汰规，獲得多肽產(chǎn)率57.33% ± 0.32%。Jemil等[25]通過枯草芽孢桿菌A26和解淀粉芽孢桿菌An6發(fā)酵沙丁魚蛋白水解物生產(chǎn)抗氧化肽和ACE抑制肽萄焦。發(fā)酵法能直接生產(chǎn)的特定多肽藥物產(chǎn)品仍然較少控轿，目前在食品冤竹、化妝品、飼料等行業(yè)應(yīng)用較多茬射。但發(fā)酵法原料易得鹦蠕，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢明顯在抛，是基因重組法的基礎(chǔ)钟病，與之結(jié)合具有更為廣泛的應(yīng)用前景。
1.1.4 基因重組法 基因重組法利用基因技術(shù)將基因片段轉(zhuǎn)移到原核或真核細胞中進行重組表達刚梭，發(fā)酵生產(chǎn)合成所需多肽肠阱，適合長肽的制備∑佣粒基因重組法中常用的工程菌為酵母菌及大腸桿菌屹徘。林靜蓮等[26]將帶有Brevinin-2GUb 基因的pET32a 載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，通過優(yōu)化表達溫度衅金，成功獲得不帶標簽的Brevinin-2GUb 多肽噪伊。Herbel 等[27]以番茄為原料，從中提取了抗菌肽Snakin-2（SN2）氮唯，將其與融合蛋白(thioredoxin A)連接鉴吹，掩蓋抗菌活性，在大腸桿菌中重組表達并優(yōu)化惩琉。經(jīng)過親和層析去除融合蛋白豆励，獲得重組SN2，收率約為1 mg/L瞒渠，對細菌和真菌具有較強的殺菌活性良蒸。基因重組法表達定向強在孝、生產(chǎn)成本低诚啃。不足之處在于開發(fā)周期長淮摔、提取純化困難私沮、產(chǎn)率低、基因表達研發(fā)難度大和橙。
1.2 化學合成法
化學合成法具有研發(fā)周期短仔燕、可快速生產(chǎn)等優(yōu)點，分為液相合成法（liquid-phase peptide synthesis魔招，LPPS）及固相合成法(solid-phase peptide synthesis晰搀，SPPS)。
1.2.1 液相合成法 液相合成法發(fā)展較早办斑，一般可分為兩種：逐步合成及片段縮合外恕。逐步合成通常是從多肽鏈的C端逐步添加連接氨基酸直至整個多肽鏈完成（圖2）杆逗。片段縮合一般先合成各個所需片段，再將各片段縮合鳞疲，合成目標多肽罪郊。液相合成法優(yōu)勢在于成本低、保護基選擇多尚洽、合成規(guī)模易放大悔橄、中間產(chǎn)物可以純化并獲得理化常數(shù)，適合短肽的合成[28]腺毫。有研究者[29]通過液相合成水溶性三肽硒谷硫酮癣疟，收率高達98%。液相合成法每步反應(yīng)后需要進行分離和純化潮酒，當合成長肽鏈時睛挚，產(chǎn)率低，過程煩瑣急黎、費時費力竞川。部分研究者對液相合成法做了優(yōu)化和創(chuàng)新，并取得一定的成效叁熔。李士杰等[30]采用微通道連續(xù)流動合成亮丙瑞林委乌，通過水洗萃取除雜，方便快捷荣回，減少了溶劑和原料消耗遭贸。
1.2.2 固相合成法 美國生物化學家Merrifield[31]于1963 年提出了固相合成法，并于1984 年獲得諾貝爾化學獎心软。固相合成法中第一個氨基酸的C 端預(yù)先固定在不溶性載體樹脂上壕吹，通過縮合反應(yīng)將該氨基酸脫保護的N 端與羧基已活化的第二個氨基酸進行連接，重復操作（縮合→洗滌→脫保護→洗滌→下一輪縮合）删铃，達到所要合成的肽鏈長度耳贬，逐步連接氨基酸，延長肽鏈猎唁，直到多肽鏈完成咒劲。接著進行切肽、修飾（若需要）诫隅、分離純化腐魂，最終獲得目標多肽（圖3）。根據(jù)α-氨基保護基不同逐纬，固相合成法可分為叔丁氧羰基（Boc）法和9-芴甲基氧羰基（Fmoc）法蛔屹。相比液相合成法，固相合成法操作方便豁生，重復進行的偶合操作易于實現(xiàn)自動化處理[33]兔毒，產(chǎn)品收率和純度較高[32]漫贞，極大地促進了多肽藥物的研究發(fā)展[34]，下文也將對此技術(shù)著重進行相關(guān)進展綜述育叁。
R—樹脂;L—連接分子;A1,A2—氨基酸
2 固相合成方法的研究現(xiàn)狀
2.1 固相合成方法和工藝
多肽固相合成法經(jīng)過幾十年的發(fā)展绕辖，目前主要可分為兩類：Boc固相合成法與Fmoc固相合成法。
2.1.1 Boc 固相合成法 在Boc 法中α-氨基用Boc保護基（圖4）進行保護擂红，側(cè)鏈則采用芐醇類作為保護基仪际。合成時使用三氟乙酸（TFA）脫除預(yù)先接在樹脂上的氨基酸α-氨基的Boc保護基，用N,N-二異丙基乙胺（DIEA）中和N 端昵骤，利用二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）進行活化树碱、偶聯(lián)下一個氨基酸，重復操作直至完成目標多肽变秦，最后以氫氟酸（HF）或三氟甲磺酸（TFMSA）進行裂解[35]成榜。Boc 法的不足之處在于反復使用強酸脫除保護來進行下一步偶聯(lián)，肽鏈容易受到酸類影響而從樹脂上切除蹦玫，而且在酸性條件下氨基酸側(cè)鏈易發(fā)生副反應(yīng)赎婚。Boc 法在多肽合成中得到廣泛應(yīng)用，Alexander 等[36]將Boc 法應(yīng)用于牛胰蛋白酶抑制劑合成樱溉，采用Boc 固相合成法制備片段肽反應(yīng)物挣输，以天然化學連接法連接，后將多肽鏈在半胱氨酸/胱氨酸氧化還原緩沖液中進行折疊獲得蛋白質(zhì)分子福贞。
2.1.2 Fmoc 固相合成法 20 世紀70 年代固相合成法得到了進一步發(fā)展撩嚼，F(xiàn)moc 保護基（圖4）開始被用于保護α-氨基[37]。Fmoc 保護基對酸穩(wěn)定挖帘，不與TFA反應(yīng)完丽，易與堿發(fā)生作用，可用堿脫除拇舀。側(cè)鏈采用Boc作為保護基逻族，而Boc 對堿穩(wěn)定。最終采用TFA 或者二氯甲烷（DCM）的TFA溶液進行裂解切肽（圖5）骄崩。
相比于Boc 法聘鳞，F(xiàn)moc 法避免了使用危害性較大的強酸HF 進行切肽，副產(chǎn)物少刁赖，收率高搁痛。代濤等[38]同樣采用Fmoc法合成布舍瑞林长搀，通過優(yōu)化投料質(zhì)量比宇弛，粗品純度達到80%，粗品經(jīng)純化純度大于98%源请，總收率為30%枪芒。瑙甘等[39]以Fmoc 固相合成法合成亮氨酸腦啡肽及甲硫氨酸腦啡肽彻况，采用LC-UV-MS聯(lián)用分析，計算得到粗產(chǎn)物含量分別為85.2%和79.8%舅踪。Liang 等[40]研究了不同F(xiàn)moc 法反應(yīng)條件下纽甘，苯甘氨酸（Phg）的外消旋化情況。發(fā)現(xiàn)Fmoc-Phg的堿催化偶聯(lián)是外消旋化的關(guān)鍵抽碌，堿性條件下樹脂結(jié)合肽具有顯著的抗異構(gòu)化能力悍赢，若使用DEPBT 或COMU 與TMP 或DMP 相結(jié)合，則消旋化可降至可忽略的水平货徙。此外Fmoc法還可通過監(jiān)測Fmoc基團的紫外特征峰監(jiān)控反應(yīng)的進展左权，方便生產(chǎn)過程控制。因此Fmoc法得到快速推廣普及痴颊，是目前最常用的多肽藥物制備方法[41]赏迟。
但是Fmoc法仍然存在一定的不足，通常合成中需要使用過量的氨基酸蠢棱、縮合劑和大量溶劑锌杀。實現(xiàn)合成綠色化是科學家們亟待解決的問題。Kumar 等[42]開發(fā)了一種綠色高效固相多肽合成方法泻仙，采用聚苯乙烯和聚乙二醇樹脂糕再，以γ-戊酸內(nèi)酯（GVL）代替溶劑DMF，使用微波輔助合成多肽玉转，純度高亿鲜，可合成長肽鏈。該方法每次循環(huán)約5 min 僅消耗溶劑15 ml冤吨。極大地提高了反應(yīng)效率蒿柳，減少了溶劑消耗。
2.2 固相合成載體
固相合成法要求所用的樹脂化學穩(wěn)定不與試劑漩蟆、氨基酸發(fā)生反應(yīng)垒探，不溶于試劑，空間位阻小怠李、具有溶脹性圾叼、有足夠的氨基酸延長空間，有一定的機械強度捺癞，可以提供足夠的連接點夷蚊。常用樹脂為聚苯乙烯-二乙烯苯、聚丙烯酰胺髓介、聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物[32]惕鼓。連接分子（活性官能團）連接樹脂與氨基酸，要求連接分子在合成過程中穩(wěn)定唐础，后續(xù)易切除且不易發(fā)生副反應(yīng)箱歧。根據(jù)連接分子不同矾飞，載體可分為：羥基樹脂、氯甲基樹脂呀邢、氨基樹脂等（表2）洒沦。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 表2 常見樹脂載體
注：
其右側(cè)為連接分子。
2.3 縮合劑及縮合機理
氨基酸脫水縮合形成肽鍵价淌，因而縮合試劑在多肽合成中必不可少[43]申眼。縮合劑主要可分成兩類（表3）：碳二亞胺型及鹽型縮合劑蝉衣。前者包括：DIC豺型、DCC、EDC·HCl 等买乃，價格經(jīng)濟姻氨，但該類型縮合劑單獨使用時副反應(yīng)較多，需通過添加HOBt剪验、HOA（t表3）等試劑控制活化過程中副反應(yīng)解決消旋化等問題（圖6）肴焊。Oxyma Pure 也是一種用于抑制外消旋并提高偶合效率的添加劑，目前已廣泛應(yīng)用于多肽合成功戚。El-Faham 等[45]以O(shè)xyma Pure 為添加劑娶眷，采用碳二亞胺（DIC）法合成了一系列新的α-酮酰胺衍生物，結(jié)果顯示使用Oxyma Pure/DIC時啸臀，產(chǎn)率和純度高于HOBt/DIC 或單獨使用DIC届宠。
鹽型縮合劑有TBTU、HBTU乘粒、HATU豌注、PyBOP（表3）等，反應(yīng)活性高灯萍，速度快轧铁，副產(chǎn)物少，抑制了消旋現(xiàn)象的發(fā)生（圖7）旦棉。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?表3 常見縮合劑及添加劑［44］
2.4 多肽藥物的工業(yè)化生產(chǎn)
多肽藥物的量產(chǎn)需要通過工業(yè)化生產(chǎn)才能實現(xiàn)齿风。在進行多肽工業(yè)化生產(chǎn)時需要考慮多方面的問題，包括技術(shù)應(yīng)用绑洛、生產(chǎn)工藝救斑、過程控制、產(chǎn)量規(guī)模真屯、設(shè)備需求脸候、生產(chǎn)成本、質(zhì)量管理、環(huán)保要求等纪他。其主要技術(shù)挑戰(zhàn)在于提純難度較大且過程控制要求高[6]鄙煤，且還需要考慮產(chǎn)量規(guī)模晾匠、生產(chǎn)布局與設(shè)備需求茶袒，控制生產(chǎn)成本。同時多肽藥物生產(chǎn)需要遵循嚴格的質(zhì)量管理規(guī)范凉馆，符合法律法規(guī)的要求薪寓，最后要重視環(huán)保要求，提高資源利用效率澜共，減少廢棄物產(chǎn)生向叉。綜上考慮，在已有的多肽合成方法中嗦董，固相合成法相對較為成熟母谎，目前已上市的多肽藥物多數(shù)是通過化學合成法制備，并且固相合成工藝占主導[15]京革。例如采用固相合成法合成縮宮素奇唤，高效、安全匹摇、環(huán)保咬扇、質(zhì)量好、自動化程度高廊勃，相比液相合成法在規(guī)模級工業(yè)化生產(chǎn)具有一定優(yōu)勢[47]懈贺。此外，化學合成法在類似物合成方面有著與生物合成法相比的獨特優(yōu)勢坡垫。通過化學合成法合成單鏈胰島素前體梭灿，可快速篩選胰島素類似物，增加化學多樣性冰悠，改善產(chǎn)物物理胎源、化學特性，從而獲得新的治療特性屿脐，實現(xiàn)胰島素類似物的工業(yè)制造[48]涕蚤。
3 分離純化方法
多肽藥物對于純度的要求較高，一般需要到達99%以上的诵，單雜0.1%以下為佳万栅。而合成獲得的粗肽成分復雜，通常是多肽混合物西疤，含目標多肽及結(jié)構(gòu)相似的多肽烦粒，因而需要進行后續(xù)分離純化。常用的方法有反相高效液相色譜法、毛細管電泳法扰她、離子交換色譜法兽掰、凝膠過濾色譜法、親和層析法等徒役。
3.1 反相高效液相色譜法
反相高效液相色譜法（reversed-phase highperformance chromatography孽尽，RP-HPLC）由非極性固定相與極性流動相組成，利用溶質(zhì)的疏水性差別進行梯度洗脫分離純化忧勿。分離效果好杉女、重現(xiàn)性強，在多肽分離純化中得到廣泛應(yīng)用[22]鸳吸。Ghribi 等[49]采用排阻色譜及反相高效液相色譜分離純化鷹嘴豆?jié)饪s蛋白酶解產(chǎn)物中新型抗氧化肽熏挎，組分Ⅲ中的P8表現(xiàn)出最高的DPPH 自由基清除活性。Girgih 等[50]發(fā)現(xiàn)反相高效液相色譜分離可增強cod 肽的降壓作用晌砾，這可能是由于其具有較強的腎素抑制活性坎拐。反相高效液相色譜法高效、快速养匈，但成本相對較高哼勇，適合多肽這類規(guī)模相對較小、附加值高的產(chǎn)品乖寒，已成為多肽主要分離純化方法猴蹂，是工業(yè)化生產(chǎn)的首選。工業(yè)級制備液相色譜通常包含輸液系統(tǒng)楣嘁、進樣系統(tǒng)磅轻、色譜柱、檢測系統(tǒng)逐虚、餾分收集聋溜、控制和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分，可自動進行平衡叭爱、進樣撮躁、沖洗、洗脫买雾、收集把曼、清洗等操作，生產(chǎn)符合GMP 等相關(guān)法律法規(guī)要求的產(chǎn)品漓穿。
3.2 毛細管電泳法
毛細管電泳（capillary electrophoresis嗤军，CE）以內(nèi)徑極小的毛細管為通道，采用直流高壓電源驅(qū)動被分離物晃危，根據(jù)被分離物的體積和帶電荷情況不同實現(xiàn)分離叙赚。高效低耗老客、操作簡便。Lamalle 等[51]利用毛細管電泳法分離魚精蛋白肽震叮，比較不同緩沖液和添加劑的多肽分離效率胧砰，發(fā)現(xiàn)采用水介質(zhì)BGE 的MEKC 方法效果最好。毛細管電泳法發(fā)展迅速苇瓣，是多肽分離分析的重要工具尉间。
3.3 離子交換色譜法
離子交換色譜（ion exchange chromatography，IEC）利用流動相攜帶多肽樣品通過離子交換柱钓简，與柱上帶有電荷的基團發(fā)生離子交換乌妒，根據(jù)所帶電荷差異汹想，實現(xiàn)對多肽樣品的分離外邓。適用于生物分子，因其一般帶有電荷古掏，人們開發(fā)了基于膜分離和離子交換色譜的大規(guī)模技術(shù)用于工業(yè)化生產(chǎn)乳源生物活性肽[52]损话。李誠等[53]采用離子交換色譜對豬皮膠原蛋白酶解液進行分離純化取得了較好的效果。離子交換色譜法分辨率高槽唾、進樣量大丧枪、耐酸堿、操作簡便庞萍，但耗材昂貴拧烦、速度慢、范圍小钝计、受環(huán)境影響較大恋博。
3.4 凝膠過濾色譜法
凝膠過濾色譜法（gel filtration chromatography，GFC）以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠為填料私恬，利用溶質(zhì)大小债沮、形狀差異進行洗脫分離。Yu 等[54]采用凝膠過濾層析本鸣、超濾疫衩、反相高效液相色譜等方法從螺旋藻酶解物中分離抗氧化肽。凝膠過濾色譜法操作條件溫和荣德，但速度較慢闷煤。
3.5 親和層析法
親和層析法（affinity chromatography，AC）利用固定相的特異性結(jié)合能力分離純化目標蛋白或其他分子[55]涮瞻。Burkova 等[56]通過瓊脂糖親和層析法純化人胎盤外顯體鲤拿，獲得抗體、多肽和小蛋白饲宛。Frolov等[57]通過結(jié)合硼酸親和層析與其他方法分析鑒定Amadori 肽皆愉。特異性強，適合低濃度樣品的分離純化。
多肽種類繁多幕庐，合成方法不同久锥，理化性質(zhì)各不相同，應(yīng)根據(jù)實際情況選擇不同的分離純化方法（表4）异剥。研究者們?yōu)榱颂岣叻蛛x純化效果瑟由，常常將多種方法結(jié)合使用[58]。此外還可采用多柱系統(tǒng)進一步提高分離純化的產(chǎn)量和收率冤寿，減少溶劑的消耗[59]歹苦。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 表4 多肽分離純化方法
此外，多肽制藥工藝離不開質(zhì)量管理督怜，嚴格的質(zhì)量控制促進工藝的提升殴瘦。多肽原料藥的質(zhì)量控制包括一般化學藥物項目及多肽類藥物特有質(zhì)控項目，前者包括性狀号杠、鑒別蚪腋、酸堿度、有關(guān)物質(zhì)姨蟋、異構(gòu)體屉凯、水分、有機溶劑及溶劑殘留眼溶、微生物限度悠砚、內(nèi)毒素、含量等堂飞。后者包含等電點灌旧、比旋度、溶解度酝静、氨基酸比值节榜、氨基酸序列、肽圖分析别智、生物活性檢查宗苍、聚合物、相關(guān)肽等[60]薄榛。其中有關(guān)物質(zhì)包含：起始物料引入的雜質(zhì)[61]讳窟、生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的工藝雜質(zhì)[62]、降解雜質(zhì)[63]敞恋，是多肽藥物質(zhì)量研究的重點丽啡。其主要研究內(nèi)容是：分析方法的建立與驗證、雜質(zhì)限度確定[64]硬猫。主要采用液相色譜法补箍、質(zhì)譜法改执、離子交換色譜法、高效分子排阻色譜法等方法進行檢測分析坑雅。質(zhì)量控制的改進提高了多肽藥物的質(zhì)量[65]辈挂。通過采用最先進的分析方法，Staby 等[66]發(fā)現(xiàn)制造工藝的差異影響利拉魯肽和索馬魯肽原料藥及產(chǎn)品穩(wěn)定性和雜質(zhì)分布裹粤，并可能影響免疫原性终蒂。
4 多肽新型技術(shù)的未來發(fā)展趨勢
隨著多肽藥物研究和發(fā)展，人們對多肽的需求不斷上升遥诉，多肽行業(yè)規(guī)模在快速增長拇泣，同時也對多肽制藥工藝提出了更高的安全、環(huán)保要求矮锈。在現(xiàn)階段霉翔，單批次千克級的合成開始變得普遍，合成和純化過程中使用大量有機溶劑愕难，對環(huán)保提出了更高要求早龟。近年來惫霸，多肽藥物肽鏈長度和復雜度逐漸增加猫缭，有些已超過30個氨基酸，合成難度高壹店，對過程監(jiān)控和自動化合成的需求不斷增加猜丹。對此，相關(guān)科研人員開展了一系列的探索和開發(fā)硅卢，探索環(huán)境友好的綠色多肽技術(shù)，應(yīng)用不斷發(fā)展的新技術(shù)，開發(fā)新型合成技術(shù)竭恬，推進自動化技術(shù)的普及與應(yīng)用卜朗，使得多肽在線監(jiān)控的自動化多肽合成工藝成為現(xiàn)實。
4.1 綠色化學反應(yīng)和工藝
多肽合成大量使用有機溶劑[67]点寥，為進一步尋求綠色環(huán)保的多肽工藝艾疟，研究者們在溶劑替代、再循環(huán)和還原以及新方法等方面進行了探索[68]敢辩。Naganna等[69]采用可溶性聚降冰片烯衍生物作載體蔽莱，減少了縮合時氨基酸和偶聯(lián)試劑的使用量。利用該載體合成天然產(chǎn)物segatalin A 的非環(huán)狀六肽前體時戚长，僅使用了已有報道中不溶性樹脂方法的八分之一偶聯(lián)劑劑量盗冷，就獲得了產(chǎn)率為41%的非環(huán)狀六肽。Raz 等[70]則采用了改良的Boc-SPPS 策略同廉，開發(fā)了一種直接合成肽硫酯的方法仪糖，避免使用無水HF柑司。有學者對Fmoc 脫保護技術(shù)進行了優(yōu)化。Jad 等[71]在評估了PS 和ChemMatrix 樹脂的溶脹性以及這兩種樹脂在液相和固相中的Fmoc脫保護作用后锅劝，發(fā)現(xiàn)低毒可生物降解的γ-戊酸內(nèi)酯可以代替DMF 去除Fmoc帜羊。P?ibylka 等[72]開發(fā)了綠色脫Fmoc 技術(shù)，脫保護時利用NaOH 和2-MeTHF 及MeOH 結(jié)合處理鸠天，避免危險試劑哌啶讼育、DCM 和DMF 等的使用，并通過合成亮氨酸腦啡肽驗證工藝稠集。Okada 等[73]改進了標記輔助液相多肽合成奶段，以疏水性苯甲醇為載體的可溶性標記輔助液相肽合成（LPPS）適用于醋酸艾替班特為模型的肽生產(chǎn)。采用改進后的工藝剥纷，每隔一步的沉淀就足以滿足整個工藝的要求痹籍，大大減少了所需的MeCN 用量。利用高效液相色譜法進行過程控制晦鞋，可確定每步原料的消耗量蹲缠，制備的醋酸艾替班特純度高于99%。
4.2 微流控技術(shù)
為進一步減少溶劑的使用悠垛，近年來线定，微流控技術(shù)開始應(yīng)用于多肽合成中。其優(yōu)點是多肽產(chǎn)物在原位即可發(fā)生裂解确买，反應(yīng)速度快斤讥、時間短；試劑微量化湾趾，降低了處理危險化合物的風險芭商；可精確控制時間及溫度，重復性高搀缠；能實現(xiàn)自動化連續(xù)合成铛楣，可快速放大[74]。Wang 等[75]設(shè)計了一種多通道連續(xù)流微流控芯片艺普，顯著縮短合成時間簸州，減少試劑用量，可實現(xiàn)短時間內(nèi)同時獲得6 個不同長度或序列的多肽衷敌，高效環(huán)保勿侯。Qiang 等[76]使用高通量微流控芯片結(jié)合綠色熒光蛋白顯色法監(jiān)測細菌細胞生長狀況，該技術(shù)可快速準確篩選潛在藥物分子缴罗，加快新藥研發(fā)速度助琐。此外還有更多技術(shù)應(yīng)用于多肽工藝，例如離子液體可以提高多肽溶解度面氓，加快偶聯(lián)反應(yīng)的進行兵钮，且不必使用大量的偶聯(lián)劑[77]蛆橡。
4.3 膜強化多肽合成法
膜強化多肽合成法（membrane-enhanced peptide synthesis，MEPS）是一種將液相多肽合成與有機溶劑納濾（organic solvent nanofiltration掘譬，OSN）相結(jié)合的新方法泰演。其合成基于可溶性高分子載體，每次反應(yīng)后葱轩，通過能保留肽的溶劑穩(wěn)定膜過濾去除副產(chǎn)物和多余試劑睦焕。重復循環(huán)氨基酸偶聯(lián)→過濾去除多余試劑→脫保護→過濾去除脫保護副產(chǎn)物與多余試劑這一過程，每一循環(huán)加入一個氨基酸直到獲得所需多肽序列[78]靴拱。So 等[79]使用MEPS 合成了兩種五肽垃喊，在相同條件下，MEPS 合成的多肽純度高于固相合成的多肽純度袜炕。Castro 等[80]研發(fā)了三種新型球形可溶性聚合物載體DPEG本谜、DNPEG 和PyPEG，截留率96%～100%偎窘，可用于膜增強多肽合成乌助，并用PyPEG 成功合成了模型肽（Fmoc-RADA-NH2）。與固相合成法相比陌知，膜增強多肽合成法受傳質(zhì)影響較小他托，同時減少反應(yīng)溶劑的過量使用。
4.4 在線監(jiān)測和智能控制
隨著合成肽鏈的延長和復雜程度上升纵诞，合成難度升高上祈，所需時間增加，成本上升浙芙，收率下降，對工藝過程控制與監(jiān)控提出了更高的要求籽腕。研究者們開發(fā)了不同監(jiān)控方法嗡呼。Tang等[81]利用標記物標記氨基末端，通過拉曼信號強度確定固相上肽的負載量皇耗。Knauer等[82]則將Fmoc引入磺跄洗埃基改造成Smoc，增強水溶性郎楼，以Smoc作為保護基進行水相固相多肽合成万伤。一方面減少有毒溶劑使用，另一方面該保護基在紫外線下呈現(xiàn)綠色熒光呜袁，通過熒光強度可判斷循環(huán)反應(yīng)的節(jié)點敌买。Sletten 等[83]將可變床流反應(yīng)器（variable bed flow reactor，VBFR）用于固相多肽合成監(jiān)測阶界，通過實時監(jiān)測樹脂膨脹和收縮引起的反應(yīng)床壓力變化監(jiān)控樹脂膨脹與收縮情況虹钮，確定氨基酸偶聯(lián)效率聋庵，通過精確定位有問題的偶聯(lián)、跟蹤樹脂聚集以及了解不同合成條件對肽序列的影響芙粱，可以在Fmoc 裂解之前對不完全偶合進行調(diào)整祭玉，優(yōu)化多肽合成。
Mijalis 等[84]?開發(fā)了自動化多肽合成法（automated flow peptide synthesis春畔，AFPS）大大加快了固相合成速度脱货。AFPS將標準Fmoc肽的酰胺鍵形成時間縮短至7 s，每個氨基酸添加周期縮短至40 s律姨。AFPS 對于化學反應(yīng)控制水平要高于手動或其他自動化方法蹭劈。在連續(xù)流動條件下，通過紫外線監(jiān)控每個循環(huán)Fmoc保護基清除情況线召，由軟件程序記錄每次合成過程中的溫度铺韧、質(zhì)量流量、壓力和紫外線吸收率等數(shù)據(jù)缓淹，并由軟件自動化控制反應(yīng)過程哈打，消除了人為誤差，重復性高讯壶。人工智能及自動化技術(shù)普及與發(fā)展料仗，代替人力進行重復性工作及數(shù)據(jù)收集工作，有利于藥物快速發(fā)現(xiàn)與開發(fā)[85]伏蚊，未來有望在化學合成領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[86]立轧。
5 總結(jié)與展望
多肽藥物療效顯著、用藥劑量小躏吊、不易產(chǎn)生耐藥性氛改，具有極高的經(jīng)濟價值和社會價值，是現(xiàn)代醫(yī)藥研究的重要方向比伏。多肽制藥工藝研究已經(jīng)成為當前多肽研究的前沿與熱點胜卤，特別是固相合成方法的廣泛使用，極大地提高了多肽藥物的工業(yè)化效率赁项。但同時也應(yīng)當注意到多肽制藥工藝存在試劑用量多等諸多問題與挑戰(zhàn)葛躏，需要多肽藥物研究者與從業(yè)者共同努力不斷改進。隨著綠色多肽工藝的開發(fā)和應(yīng)用及微流控技術(shù)悠菜、膜強化多肽合成技術(shù)舰攒、在線監(jiān)控與自動化技術(shù)等新技術(shù)的廣泛使用，多肽制藥工藝將得到進一步發(fā)展和提高悔醋。
人工智能自動化控制技術(shù)等眾多高新技術(shù)與多肽合成工藝的有效融合摩窃，在線檢測和智能控制系統(tǒng)的應(yīng)用減少人力投入，提高研發(fā)效率篙顺，降低研發(fā)成本偶芍，必將有助于多肽藥物的開發(fā)和應(yīng)用充择。多肽藥物的發(fā)展對多肽分離純化提出了更高的要求，單獨使用一種方法很難達到理想的效果匪蟀，因而采用多種技術(shù)聯(lián)合使用提高分離純化效率將是一大趨勢椎麦，與此同時，分離純化新技術(shù)也會逐步得到應(yīng)用材彪。相信在相關(guān)領(lǐng)域科研人員的共同努力下观挎，更先進的綠色多肽制藥技術(shù)能夠在未來幾年里助推更多的多肽藥物進入臨床試驗和獲批上市，面向人民生命健康需求做出新的貢獻段化。
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