大家好成肘，我是小燕同學(xué)卖局，今天為大家介紹7種常用中藥靶點(diǎn)鑒定方法，主要包括標(biāo)記類分子靶點(diǎn)“釣鉤”策略双霍、SILAC標(biāo)記識(shí)別砚偶、點(diǎn)擊化學(xué)和非標(biāo)記類DARTS、SPROX洒闸、CESTA染坯、TPP。

▲標(biāo)記類

1. 分子靶點(diǎn)“釣鉤”策略

i.工作原理：首先將藥物分子通過(guò)化學(xué)手段進(jìn)行修飾, 鏈接一個(gè)標(biāo)簽分子(如生物素), 進(jìn)而利用標(biāo)簽分子與固相載體微球表面的活性反應(yīng)基團(tuán)相互作用, 將該藥物分子連接到微球表面,得到藥物分子修飾的固相微球顷蟀，繼而將微球與細(xì)胞裂解液混合, 使微球表面的藥物分子捕捉靶點(diǎn)蛋白, 并富集到微球表面, 最后經(jīng)凝膠電泳分離純化, 高分辨質(zhì)譜分析, 以及數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì), 確定該靶點(diǎn)蛋白的名稱及屬性酒请。

ii. 適用與缺陷：①預(yù)先標(biāo)記、結(jié)構(gòu)修飾小分子鸣个，適用于中藥單體羞反；②需要區(qū)分真正的高親和力靶標(biāo)蛋白質(zhì)與低親和力但豐度高的蛋白質(zhì)；洗脫過(guò)程依賴經(jīng)驗(yàn)囤萤，洗滌條件過(guò)強(qiáng)會(huì)大大減少鑒定到的靶點(diǎn)數(shù)昼窗，而洗脫條件過(guò)弱則會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)瓊脂糖珠上的非特異性吸附也會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果涛舍；由于生物素相對(duì)分子質(zhì)量較大澄惊，會(huì)在一定程度上影響化合物的脂溶性使其不易進(jìn)入細(xì)胞，受空間位阻較大影響化合物與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合富雅。

2.基于SILAC標(biāo)記識(shí)別技術(shù)

i.工作原理：通過(guò)使用天然同位素(輕標(biāo))和穩(wěn)定同位素(重標(biāo))標(biāo)記的必需氨基酸取代細(xì)胞培養(yǎng)基中的相應(yīng)氨基酸, 使穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸摻入到細(xì)胞新合成的蛋白質(zhì)中, 替代原有氨基酸, 再通過(guò)高分辨質(zhì)譜對(duì)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量掸驱。

ii.技術(shù)應(yīng)用（藥物靶點(diǎn)鑒定）：將重標(biāo)同位素標(biāo)記的細(xì)胞裂解液用于靶點(diǎn)捕獲, 而輕標(biāo)同位素標(biāo)記的細(xì)胞裂解液作為空白對(duì)照, 然后使用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞裂解液中捕獲的不同種類蛋白量的差異, 進(jìn)而尋找含量差異較大的蛋白作為潛在的藥物靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)研究。

iii.適用特點(diǎn)：適用于細(xì)胞內(nèi)的低豐度蛋白特別是痕量蛋白的識(shí)別與鑒定没佑；適用于中藥單體毕贼。

3. 基于“點(diǎn)擊化學(xué)”的靶點(diǎn)鑒定

i.工作原理：盡可能小的改變化合物生物活性的前提下，通過(guò)引入光交聯(lián)集團(tuán)蛤奢、炔基或疊氮構(gòu)建活性分子探針鬼癣，在細(xì)胞內(nèi)利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將藥物分子與靶點(diǎn)蛋白直接“固定”在一起（分子探針與細(xì)胞孵育）, 再通過(guò)裂解細(xì)胞和富集靶點(diǎn)等操作純化藥物靶點(diǎn), 最后經(jīng)高分辨質(zhì)譜進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白鑒定陶贼。

ii.特點(diǎn)及適用：PAL技術(shù)既幫助標(biāo)記細(xì)胞或者細(xì)胞裂解液中低豐度或者與探針親和力較弱的靶蛋白，也可標(biāo)記膜上受體等通常不易鑒定的蛋白待秃；適用于中藥單體（如青蒿素拜秧、姜黃素、黃芩苷）章郁。若與蛋白質(zhì)組學(xué)芯片聯(lián)用枉氮，可應(yīng)用于中藥復(fù)方等復(fù)雜體系靶點(diǎn)鑒定。

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▲非標(biāo)記類

4. DARTS（藥物親和反應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性分析）

i.工作原理：利用藥物結(jié)合時(shí)靶標(biāo)蛋白對(duì)蛋白酶降解的敏感性降低這一特性驱犹，不需要對(duì)藥物結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾且不依賴藥物的活性嘲恍，依賴于藥物分子和其蛋白質(zhì)靶點(diǎn)之間的親和性，因此能夠精確地找到藥物的直接結(jié)合靶點(diǎn)雄驹。

ii.大致流程：細(xì)胞裂解佃牛、蛋白定量、加入小分子藥物與裂解液共同孵育医舆、鏈霉蛋白酶水解俘侠，最后采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、Western blot蔬将。

iii.適用與缺陷：適用于中藥單體爷速，但DARTS 技術(shù)受限于質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度，對(duì)于許多低豐度的靶標(biāo)蛋白來(lái)說(shuō)不易將目標(biāo)蛋白可視化霞怀，此外進(jìn)化選擇上有些蛋白很難被蛋白酶消化惫东。

5. SPROX（氧化速率蛋白穩(wěn)定性分析）

i.工作原理：基于蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)配體的熱力學(xué)穩(wěn)定性，即在化學(xué)變性劑（如鹽酸胍或尿素）濃度增加的情況下利用過(guò)氧化氫氧化蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸（氧化產(chǎn)物為甲硫氨酸亞砜或甲硫氨酸砜）毙石，用電噴霧或基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜法測(cè)定特定氧化時(shí)間下甲硫氨酸的氧化程度與變性劑濃度的函數(shù)廉沮，未氧化產(chǎn)物、氧化產(chǎn)物變性劑關(guān)系曲線的交點(diǎn)為遷移中點(diǎn)徐矩，由于蛋白質(zhì)和其配體結(jié)合后蛋白穩(wěn)定性提高滞时，與對(duì)照組相比，在相同濃度的氧化產(chǎn)物下需要更多的變性劑滤灯，從而導(dǎo)致遷移中點(diǎn)右移坪稽。SPROX 優(yōu)點(diǎn)在于不需要純化蛋白，且可以與串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽TMT鳞骤、SILAC相結(jié)合窒百，通過(guò)標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基來(lái)確定肽的相對(duì)含量。

ii. 適用與缺陷：只能檢測(cè)含有甲硫氨酸的蛋白質(zhì)與小分子的結(jié)合豫尽，此外并不是所有的甲氨酸殘基都表現(xiàn)出不同的氧化速率贝咙，因此不能完全確證蛋白質(zhì)和配體相互作用。

6. CESTA（蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性分析）

i.工作原理：基于配體誘導(dǎo)的靶標(biāo)蛋白熱穩(wěn)定性改變?cè)黹_(kāi)發(fā)出 CETSA 技術(shù)拂募，隨著溫度的升高庭猩，蛋白熱穩(wěn)定性降低，而小分子和靶標(biāo)蛋白結(jié)合后會(huì)改變靶標(biāo)蛋白的熱穩(wěn)定性陈症。

ii.大致流程：將多個(gè)等量的細(xì)胞裂解液或者組織勻漿液或活細(xì)胞與小分子孵育蔼水，設(shè)置空白對(duì)照組和藥物處理組，然后加熱至不同溫度進(jìn)行熱變性录肯；冷卻后趴腋，將樣品離心，從沉淀蛋白中分離可溶性組分论咏；通過(guò)Western blotting 法對(duì)可溶性部分中的目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量优炬，或基于質(zhì)譜方法根據(jù)其熔解曲線分析可溶性蛋白的熱穩(wěn)定性，從而確證小分子與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合厅贪。

iii.缺陷：①較大的蛋白質(zhì)包括蛋白質(zhì)復(fù)合物更可能產(chǎn)生較弱或沒(méi)有配體誘導(dǎo)反應(yīng)蠢护，在這方面的局限性仍需充分證實(shí)；②加熱會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性养涮，可以通過(guò)減少加熱時(shí)間葵硕、選擇合適的加熱方式、增加對(duì)照實(shí)驗(yàn)來(lái)解決贯吓；③小分子的孵育時(shí)間會(huì)影響小分子識(shí)別靶標(biāo)蛋白懈凹，如果此化合物參與快速響應(yīng)信號(hào)通路，可能會(huì)影響靶標(biāo)蛋白翻譯后的狀態(tài)悄谐，進(jìn)而影響抗體對(duì)靶標(biāo)蛋白的檢測(cè)介评，可以使用基于質(zhì)譜方法來(lái)檢測(cè)靶標(biāo)蛋白；④檢測(cè)需要的藥物濃度較高爬舰，在發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)的過(guò)程中明顯通量不足们陆，常被用作靶點(diǎn)的驗(yàn)證。

7. TPP（熱蛋白組分析）--多技術(shù)聯(lián)用

i.簡(jiǎn)介：將 CETSA 技術(shù)和多重定量質(zhì)譜相結(jié)合洼专，可以監(jiān)測(cè)藥物作用過(guò)程中整個(gè)蛋白組蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的變化棒掠，增加了在靶點(diǎn)和脫靶識(shí)別以及生物識(shí)別上的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)蛋白的高通量檢測(cè)屁商，適用于體外烟很、原位和體內(nèi)檢測(cè)。

ii.大致流程：將細(xì)胞或裂解液在有無(wú)化合物條件下處理蜡镶，然后將樣本平均分成 10 份雾袱，在 10 個(gè)溫度下分別加熱，用 PBS 溶液提取可溶部分官还，再用胰蛋白酶處理樣本并用 TMT10 進(jìn)行標(biāo)記芹橡，最后混合所有樣本進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析，得到的報(bào)告離子強(qiáng)度用于擬合曲線并計(jì)算每個(gè)蛋白質(zhì)的特定熔解溫度（Tm）望伦，從而找到穩(wěn)定性差異蛋白林说。