最近的一次組會上看到實(shí)驗(yàn)室的同學(xué)匯報的結(jié)果里有Hi-C的圖崖蜜，所以我就悄咪咪的去了解了一下Hi-C技術(shù)的原理。整理一下。
Q1: Hi-C的全稱是什么苟鸯？
A: 高通量染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)（High-throughput chromosome conformation capture）
Q2: 簡單的說，Hi-C技術(shù)是干嘛的棚点？
A: Hi-C 是以整個細(xì)胞核為研究對象早处，利用高通量測序技術(shù)，研究全基因組范圍內(nèi)整個染色質(zhì) DNA 在空間位置上的關(guān)系瘫析，捕獲不同基因座位上之間的空間交互信息砌梆。Hi-C 可以與 RNA-Seq、ChIP-Seq 等數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析颁股，從基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)來闡述生物體性狀形成的相關(guān)機(jī)制么库。（參考文章：Hi-C 技術(shù), Hi-C技術(shù)到底能做什么？）
Q3: Hi-C的實(shí)驗(yàn)流程是什么甘有？
A: 可以參考哈佛大學(xué)錄制的視頻诉儒，20多分鐘，里面介紹了詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)流程亏掀。這個視頻的好處是還可以選擇播放速度忱反，英文不太好的童鞋也不用擔(dān)心，讓它慢一點(diǎn)播放就行了滤愕。點(diǎn)這里：Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.
一般流程：
（1）細(xì)胞（2 x 10^ 7至2.5 x 10 ^7）用甲醛交聯(lián)温算，如此一來，在空間上相互作用的染色質(zhì)片段之間產(chǎn)生共價鍵（上圖中DNA片段：藍(lán)色间影，紅色注竿。中間的環(huán)狀的是protein）。
（2）染色質(zhì)用限制酶（此處為HindIII；限制位點(diǎn)：虛線）消化巩割。產(chǎn)生的粘性末端被核苷酸填充一部分裙顽，并且被標(biāo)記生物素（紫色點(diǎn)）。這里需要注意的是宣谈，你需要有一個空白對照愈犹，即沒有HindIII處理的樣品，因?yàn)槟阈枰苣z檢查你的酶切結(jié)果闻丑。
（3）連接：是在極稀的條件下進(jìn)行的漩怎，有利于分子內(nèi)連接。這時HindIII酶切位點(diǎn)就沒了嗦嗡，多出了一個NheI位點(diǎn)勋锤。再進(jìn)行酶切。
NOTE:這里要進(jìn)行質(zhì)量檢測：
上圖里酸钦，A圖是分別用不同量的3C和Hi-C文庫跑的膠怪得。一般來說Hi-C文庫的連接效率要比3C稍微低一些，所以會有一些彌散的感覺卑硫。質(zhì)量控制步驟應(yīng)顯示3C和Hi-C庫均大于10 kb徒恋。DNA條帶彌散表明連接效率差。B圖里分別是不同的對照和進(jìn)行兩次酶切的DNA膠結(jié)果圖欢伏。NheI切割了70％的Hi-C擴(kuò)增子入挣。
（4）純化和剪切DNA。
（5）使用鏈霉親和素珠分離生物素標(biāo)記的片段硝拧。然后進(jìn)行測序径筏。
Q4: 如何知道Hi-C測序的質(zhì)量如何？
A: 上圖A中障陶，與隨機(jī)產(chǎn)生的read（綠色）相比滋恬，染色體內(nèi)（藍(lán)色）和染色體間（紅色）相互作用的片段的reads明顯更接近HindIII限制性酶切位點(diǎn)。隨著距HindIII位點(diǎn)的距離增加抱究，染色體內(nèi)讀數(shù)和染色體間讀數(shù)曲線都迅速減小,直到染色體在?500 bp處達(dá)到平穩(wěn)為止恢氯。500bp是用于測序的最大片段大小。圖B說的是鼓寺，通常勋拟，55％的可比對的reads 對代表染色體間相互作用。15％表示間隔小于20 kb的染色體內(nèi)片段之間的相互作用妈候，而30％的reads表示間隔大于20 kb的染色體內(nèi)的相互作用敢靡。這種分布可以作為質(zhì)量控制的一種形式。
Q5: Hi-C數(shù)據(jù)的分析流程是什么苦银？
參考：生信技能樹：3D基因組之Hi-C數(shù)據(jù)分析(大全)啸胧， 三維基因組學(xué)研究之Hi-C
（1）數(shù)據(jù)過濾赶站。
（2）比對：比對的方式主要分兩種，一種判斷每條reads是否含有酶切位點(diǎn)吓揪，有則去掉酶切位點(diǎn)之后的數(shù)據(jù)在進(jìn)行bowtie2單端比對亲怠；另一種采用單端比對的策略，以25bp為起始長度柠辞，每次增加5bp直到該reads比對到基因組具有唯一性。
（3）尋找酶切片段主胧；比對尋找到reads pairs在基因組物理位置之后叭首，通過插入片段大小的限制搜索reads pairs兩端每條read所對應(yīng)的最近的酶切片段。酶切片段的位置代表了DNA交互產(chǎn)生的大致位置踪栋。
（4）篩選fragment pairs
（5）HiC分析：只需要Valid Pairs
Binning：將Valid Pairs的交互信息mapping到基因組的位置焙格，最終轉(zhuǎn)換成為每兩個bin的交互強(qiáng)度。
（6）交互矩陣標(biāo)準(zhǔn)化夷都；標(biāo)準(zhǔn)化方法主要分為兩類眷唉，一類是基于矩陣，進(jìn)行數(shù)學(xué)上的標(biāo)準(zhǔn)化囤官，例如迭代等冬阳，另一類是基于生物學(xué)意義（例如mappingability）上的標(biāo)準(zhǔn)化。
（7）可視化
Q6: Hi-C測序的結(jié)果圖怎么看党饮？
A: 染色質(zhì)相互作用可以用熱圖表示肝陪，其中x軸和y軸代表基因組順序的基因座。通常來說刑顺，線性基因組中非常接近的DNA片段將傾向于相互頻繁交互氯窍。所以在熱圖中可以看到對角線的相互作用很高（下圖）。下圖展示的是14號染色體內(nèi)的基因座相互作用：
上面圖A對應(yīng)于14號染色體上染色體內(nèi)相互作用的熱圖蹲堂。每個像素代表1-Mb位點(diǎn)和另一個1-Mb位點(diǎn)之間的所有相互作用狼讨。紅色密度對應(yīng)于reads的數(shù)量∑饩海刻度線每個刻度10 Mb政供。使用Hi-C數(shù)據(jù)集計算給定基因組內(nèi)一對基因座(loci)的平均接觸概率，產(chǎn)生一個期望矩陣（B）能犯。matrix A和B兩個矩陣的商是觀察/期望的矩陣（C）鲫骗，其中富集顯示為紅色。塊模式變得更加明顯踩晶。Person相關(guān)矩陣（D）說明了14染色體的每對基因座的相互作用相關(guān)性执泰。
你還可以看染色體之間的相互作用：
上圖A中，相互作用的概率隨著染色體1上基因距離的變化而降低，最終在90Mb達(dá)到平穩(wěn)（藍(lán)色線）热某。不同染色體間相互作用的水平對于不同的染色體對是不同的。1號染色體上的基因座最有可能與10號染色體上的基因座（綠色）相互作用各吨，最不可能與21號染色體上的基因座（紅色）相互作用排苍。相對于染色體內(nèi)相互作用沦寂，染色體間的相互作用被消除了。圖B里所有染色體之間的觀察/預(yù)期熱圖淘衙。紅色表示富集传藏。一般富含基因的小染色體往往存在更多的相互作用。
Q7: TAD圖怎么看彤守？
我在實(shí)驗(yàn)室人的匯報里看到類似如下的圖：
參考：TAD:拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域簡介
這其實(shí)是染色質(zhì)相互作用圖里對角線一側(cè)的數(shù)據(jù)毯侦。這種重復(fù)出現(xiàn)的（紅色三角）內(nèi)部互作頻率高，組間互作頻率低的domain具垫，稱為topologically assocaited domain, 簡稱TAD侈离。這個圖怎么理解呢，我發(fā)現(xiàn)了生信修煉手冊公眾號里的一張圖片筝蚕，非常簡單易懂：
兩個大紅三角的中間被稱為：TAD邊界卦碾。
那么如何識別染色質(zhì)中的TAD,這里有一個名詞：DI，方向性指數(shù)起宽。用于量化基因組區(qū)域的上游或下游相互作用偏差的程度洲胖，發(fā)現(xiàn)在TAD邊界區(qū)的偏差很大。（參考：3D基因組入門筆記）
TAD與Chip-Seq結(jié)果一起看（圖片來自：3D基因組入門筆記）：
TAD圖和Chip-seq一起看燎含，可以看在TAD邊界處或內(nèi)部宾濒，不同的protein或者染色質(zhì)修飾mark的結(jié)合情況。比如上面這個圖屏箍，CTCF可以幫助染色體折疊绘梦，那么它結(jié)合的地方，顯然是很難與其他地方相互作用的赴魁，所以與絕緣子相關(guān)卸奉。
