0.引言
微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）士飒，是由于錯(cuò)配修復(fù)（MMR）基因突變導(dǎo)致錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失而引起的对蒲，自1993年Altonen等首次在遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC）中發(fā)現(xiàn)存在高頻MSI（MSI-H）后奖蔓，人們發(fā)現(xiàn) MSI 在結(jié)直腸癌中不僅具有診斷價(jià)值，更可以指導(dǎo)治療， NCCN 指南已將 MSI 列為結(jié)直腸癌患者預(yù)后以及輔助化療療效的預(yù)測指標(biāo)寝受。
對于不同腫瘤偎窘，其存在 dMMR/MSI-H 的比率是不同的乌助，具體比例如下圖所示：
當(dāng)腫瘤細(xì)胞中存在 MMR 基因功能缺失（Mis-Match Repair deficiency溜在，簡稱 dMMR）時(shí)，標(biāo)志腫瘤細(xì)胞失去對DNA 復(fù)制錯(cuò)誤的修復(fù)能力他托，腫瘤細(xì)胞內(nèi)將積累大量突變掖肋，就會(huì)伴隨出現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）特征。
所以通過腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）檢測區(qū)分出 MSI-H 實(shí)體瘤患者赏参，具有重大臨床意義志笼。
1、MSI介紹
微衛(wèi)星是真核生物基因組中均勻分布的登刺、短串聯(lián)重復(fù)序列或簡單重復(fù)序列籽腕，一般由1～6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)單元構(gòu)成，重復(fù)5至50次不等纸俭，其重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異皇耗。在DNA的復(fù)制過程中，DNA聚合酶在遇到串聯(lián)重復(fù)序列時(shí)會(huì)發(fā)生“打滑”揍很，引起微衛(wèi)星位點(diǎn)中核苷酸的插入或缺失郎楼。而這一過程可以被錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair,MMR）系統(tǒng)所識(shí)別并修復(fù)，若MMR基因發(fā)生啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化或編碼區(qū)的突變窒悔，導(dǎo)致其功能喪失呜袁，則會(huì)無法及時(shí)修復(fù)微衛(wèi)星中自發(fā)的高頻長度變異，從而引起MSI简珠。人類基因組中有數(shù)以萬計(jì)的微衛(wèi)星位點(diǎn), 這些微衛(wèi)星位點(diǎn)近似均勻地分布在各個(gè)染色體上, 所有的微衛(wèi)星序列約占整個(gè)基因組的3%.
目前已有大量證據(jù)表明阶界，dMMR/MSI-H是II期CRC患者預(yù)后良好的一個(gè)標(biāo)志物。因此聋庵，對于具有dMMR/MSI-H腫瘤的II期CRC患者膘融，3/4級分化（低分化）不再認(rèn)為是高危因素。但是祭玉，期的結(jié)直腸癌與/期相比氧映，MSI-H患者的病理類型更差，生存結(jié)局也更差脱货。這些研究也支持了在dMMR進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者的無進(jìn)展生存（PFS）和OS結(jié)局更不盡如人意的研究結(jié)果岛都，有研究顯示，dMMR可作為5-FU輔助治療CRC無效的預(yù)測標(biāo)志物振峻。
2017年5月FDA 批準(zhǔn)了Pembrolizumab用于任何 “MSI-H/dMMR亞型” 的實(shí)體瘤臼疫。
2017年8月FDA 又批準(zhǔn) nivolumab 用于既往接受氟尿嘧啶、奧沙利鉑扣孟、伊立替康治療后病情進(jìn)展且攜帶微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高（MSI-H）或錯(cuò)配修復(fù)缺陷（dMMR）的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）成人及12歲及以上兒科患者的治療烫堤。
可以歸納為：
現(xiàn)象：即測序數(shù)據(jù)中表現(xiàn)出的微衛(wèi)星位點(diǎn)重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)的波動(dòng),；
本質(zhì)：堿基的插入與刪除;
機(jī)制： 即DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)相關(guān)基因啟動(dòng)子超甲基化或發(fā)生突變使得這些基因無法表達(dá), 進(jìn)而影響到錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的功能.；
2塔逃、檢測方法
- 免疫組化法（IHC）
MSI 常由MMR基因突變及功能缺失導(dǎo)致，因此可以通過免疫組化檢測腫瘤組織中MMR蛋白缺失來間接確定MSI的狀態(tài)料仗。IHC主要是檢測MMR蛋白（MLH1湾盗、MSH2、MSH6和PMS2）表達(dá)情況立轧，蛋白正常表達(dá)為MSI-L/MSS格粪，只要有任一個(gè)蛋白功能缺失，即為MSI-H氛改，見表1帐萎。
免疫組化檢測的優(yōu)勢是可以直接鑒定出導(dǎo)致 MSI 發(fā)生的 MMR 缺陷基因，但是胜卤，約5%-11%的MSI發(fā)生并不會(huì)出現(xiàn) MMR 蛋白的缺陷疆导。另外某些 MMR 蛋白錯(cuò)義突變，MMR 功能損失卻保留其抗原性葛躏，免疫組化檢查出現(xiàn)假陽性澈段，而多重?zé)晒?PCR-MSI 檢測正好可以彌補(bǔ)。
2.MMR基因直接測序
對 MMR 基因各區(qū)域（MLH1舰攒、MSH2败富、MSH6等）的擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序，該方法可以得到 MMR 基因突變的直接證據(jù)摩窃，但是不能提供基因功能異常的證據(jù)兽叮，并且不能檢測出基因啟動(dòng)子的甲基化情況，而甲基化是高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)的常見原因猾愿。
3.多重?zé)晒釶CR
通過對腫瘤組織和正常組織中選定的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及凝膠電泳, 通過比較兩組電泳結(jié)果的差異來確定MSI的狀態(tài). 然而人類基因組中有數(shù)以萬計(jì)的微衛(wèi)星位點(diǎn), 不同的位點(diǎn)對于檢測MSI的敏感性和準(zhǔn)確性也各不相同鹦聪。多重PCR 是 MSI 檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，可重復(fù)性強(qiáng)匪蟀，是對腫瘤組織 MSI 狀態(tài)的直接反應(yīng)椎麦。但是 PCR 檢測結(jié)果不能顯示4種修復(fù)蛋白中哪種蛋白功能缺陷，因此它不能區(qū)分與 MSI 有關(guān)的結(jié)直腸癌是散發(fā)性或是 Lynch Syndrome材彪。
實(shí)驗(yàn)方法的局限性：
首先, 需要耗費(fèi)一定的時(shí)間和人力;
其次, 結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴于分析人員的肉眼判斷;
再者, 微衛(wèi)星標(biāo)記和MMR蛋白都有其局限性.
對于微衛(wèi)星標(biāo)記, 實(shí)驗(yàn)中選擇的數(shù)量有限, 存在組織(腫瘤)特異性, 無法準(zhǔn)確地在多種腫瘤中檢測MSI狀態(tài);
對于MMR蛋白, 由于MMR可能不是引起MSI的唯一原因, 以及MMR自身的復(fù)雜性, 使用MMR蛋白的表達(dá)來間接判斷MSI狀態(tài)也存在局限性观挎。
計(jì)算方法的優(yōu)勢：
利用測序數(shù)據(jù), 可以對樣本的MSI狀態(tài)作出全面的評估. 相比于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法, 計(jì)算方法的眾多優(yōu)勢使其可能在未來用于微衛(wèi)星不穩(wěn)定的臨床檢測. 在這個(gè)過程中, 還需要考慮以下方面的問題. 首先, 數(shù)據(jù)支持. 不論是基于一般統(tǒng)計(jì)模型的方法還是基于機(jī)器學(xué)習(xí)模型的方法, 要確定合適的閾值或提高分類器的準(zhǔn)確性都需要大量數(shù)據(jù)的支持. 其次, 軟件易用性. 軟件要易于安裝, 其使用應(yīng)該在最大程度上實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化同時(shí)運(yùn)行時(shí)間需要在可接受的范圍內(nèi).
3、常用工具（來自 <</span>http://www.c-s-a.org.cn/html/2018/10/6591.html> ）
方法分類：
【a】模型
從模型的角度可以將這些方法分為基于一般統(tǒng)計(jì)模型的方法和基于機(jī)器學(xué)習(xí)模型的方法段化。
（1）基于統(tǒng)計(jì)的方法, 首先選取一個(gè)可以反映微衛(wèi)星不穩(wěn)定特點(diǎn)的指標(biāo), 然后在一組給定的樣本上(MSI的臨床檢測結(jié)果已知), 確定該指標(biāo)與臨床檢測結(jié)果的一致性及分類閾值嘁捷。
（2）基于機(jī)器學(xué)習(xí)的方法, 主要通過特征提取、特征選擇及分類器訓(xùn)練的方法進(jìn)行MSI狀態(tài)的預(yù)測显熏。
【2】樣本：
從樣本的角度可以將這些方法分為基于配對的腫瘤-正常樣本的方法和僅基于腫瘤樣本的方法雄嚣。
方法介紹
【a】基于一般統(tǒng)計(jì)模型的MSI檢測方法
（1）基于Indel的MSI檢測方法
MSI中發(fā)生的重復(fù)單元的插入與刪除從本質(zhì)上是小片段堿基的插入與刪除, 即Indel. Lu等人正是從這個(gè)角度出發(fā), 將MSI的判定問題轉(zhuǎn)化為了微衛(wèi)星區(qū)域的Indel變化問題.
對于每個(gè)樣本, 首先進(jìn)行Indel識(shí)別, 其次對獲得的Indel進(jìn)行過濾并保留位于微衛(wèi)星區(qū)域的Indel. 通過在一組樣本(MSI臨床檢測結(jié)果已知)上對PI、PD以及PI/PD作為MSI判別指標(biāo)進(jìn)行t檢驗(yàn)評估(其中PI表示微衛(wèi)星區(qū)域insertion占所有insertion的比例, PD表示微衛(wèi)星區(qū)域deletion占所有deletion的比例, PI/PD為二者的比率), 選擇了PI/PD作為樣本的MSI判別指標(biāo). MSI-H的樣本在該指標(biāo)上的取值顯著低于MSS的樣本.
mSINGS首先判斷每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的穩(wěn)定性, 進(jìn)一步根據(jù)不穩(wěn)定的微衛(wèi)星位點(diǎn)的比例來判斷樣本的MSI狀態(tài). 對于每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn), mSINGS試圖找到一個(gè)指標(biāo)來量化其穩(wěn)定程度, 并基于一組MSS樣本建立各微衛(wèi)星位點(diǎn)該指標(biāo)的參考值, 對于給定樣本的某個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn), 若該指標(biāo)取值超出參考范圍, 則認(rèn)為該微衛(wèi)星位點(diǎn)不穩(wěn)定. 通過這種方式, mSINGS解決了僅有腫瘤樣本情況下MSI的判定問題。該方法是使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法來判斷缓升，但關(guān)鍵問題是樣本的選取鼓鲁，包括樣本的個(gè)數(shù)，癌種等港谊。
（3）MSIsensor（推薦使用）
與mSINGS相似, MSIsensor也是通過分別判斷每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的穩(wěn)定性, 然后以不穩(wěn)定微衛(wèi)星位點(diǎn)的比例作為MSI得分. 不同的是, MSIsensor需要基于配對的腫瘤-正常樣本進(jìn)行MSI的判定. 首先, 對于在腫瘤和正常樣本中測序深度均大于等于20的微衛(wèi)星位點(diǎn), 計(jì)算其等位基因的分布信息; 其次, 通過卡方檢驗(yàn)比較腫瘤和正常樣本的相同微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因分布, 若顯著不同, 則認(rèn)為該微衛(wèi)星位點(diǎn)不穩(wěn)定; 最后統(tǒng)計(jì)不穩(wěn)定位點(diǎn)的比例, 若該比例超過閾值, 則判定為MSI-H, 其中, 閾值是通過該指標(biāo)在一組樣本上(包括MSI-H和MSS的樣本)的累積分布確定的,此軟件目前來看相對校準(zhǔn)骇吭。
（4）MANTIS
類似于MSIsensor, MANTIS也獲得了腫瘤-正常配對樣本在每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因分布信息; 與MSIsensor不同的是, 對于每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn), MANTIS把上述兩組數(shù)據(jù)看作兩個(gè)向量, 定義這兩個(gè)向量的 L1范數(shù)為樣本中該位點(diǎn)的穩(wěn)定程度, 對所有位點(diǎn)的L1范數(shù)求平均值即為樣本的MSI得分。
【b】基于機(jī)器學(xué)習(xí)模型的MSI檢測方法
（1）MSIseq
發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定的樣本其單核苷酸替代(Single Nucleotide Substitution, SNS)率以及小片段堿基的插入與刪除(Indel)比率都會(huì)發(fā)生變化, MSIseq主要是從基因變異這一角度出發(fā)選取特征的歧寺。MSIseq使用五折交叉驗(yàn)證分別基于LR燥狰、決策樹、隨機(jī)森林斜筐、樸素貝葉斯算法訓(xùn)練了分類器并評估了性能, 最終選擇基于決策樹算法的分類器, 該分類器僅使用了S.ind這一個(gè)特征.
（2） MOSAIC
MOSAIC是基于對每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)穩(wěn)定性的判斷設(shè)計(jì)特征的. 除了與各微衛(wèi)星位點(diǎn)穩(wěn)定性相關(guān)的特征外, 還增加了通過在一組樣本上對所有微衛(wèi)星位點(diǎn)的穩(wěn)定性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)的顯著不穩(wěn)定的微衛(wèi)星位點(diǎn)信
MOSAIC分別基于決策樹和隨機(jī)森林算法訓(xùn)練了模型, 最終選擇了基于決策樹算法的分類器, 該分類器僅使用了peak_avg以及defsite兩個(gè)特征 .
【c】EDB-MSI新算法檢測腫瘤MSI狀態(tài)具有更高準(zhǔn)確性
EDB-MSI算法是基于NGS的新型微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測的算法龙致。它是基于MSI文獻(xiàn)積累的歷史致病位點(diǎn)，選取目標(biāo)區(qū)域上與癌癥相關(guān)的13個(gè)MS位點(diǎn)顷链，代號為MSI1－MSI13目代。通過統(tǒng)計(jì)待檢測樣本和與之配對的對照樣本在上述13個(gè)MS位點(diǎn)處重復(fù)單位的長度的分布情況，得到每個(gè)位點(diǎn)的MSI風(fēng)險(xiǎn)評分嗤练。最后像啼，通過綜合考慮13個(gè)目標(biāo)MS位點(diǎn)的得分情況來給出待檢測樣本的整體MSI狀態(tài)。
研究結(jié)果顯示潭苞，基于EDB-MSI方法所得結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)MSI-PCR結(jié)果有較高的一致性忽冻，且可避免人為干擾因素導(dǎo)致的結(jié)果不準(zhǔn)確性。EDB-MSI方法與其它的MSI-NGS方法進(jìn)行比較此疹，如MANTIS僧诚，MSISensor，mSINGS蝗碎，MSI_baseline等湖笨，結(jié)果表明，EDB-MSI方法的準(zhǔn)確性最高蹦骑。EDB-MSI算法對分析結(jié)直腸癌患者的MSI狀態(tài)有潛在的效用慈省，后續(xù)可考慮將該算法應(yīng)用于癌癥樣本的MSI狀態(tài)分析。
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