1.為什么寫(xiě)？
網(wǎng)上教程一抓一大把榛瓮，有的能重復(fù)铺董，有的不能重復(fù)不了，很多原因禀晓。別人能做的不代表你能復(fù)制精续，實(shí)踐出真知。
不做搬運(yùn)工粹懒，只寫(xiě)有用的重付，防止以后忘記。每個(gè)人理解不同凫乖，記錄下來(lái)棵帽，供自己今后參考樱蛤，順便分享他人邑商。
2.GSEA基本概念
Gene Set Enrichment Analysis
思路：
使用預(yù)定義的基因集（通常來(lái)自功能注釋或先前實(shí)驗(yàn)的結(jié)果）督函，將基因按照在兩類樣本中的差異表達(dá)程度排序，然后檢驗(yàn)預(yù)先設(shè)定的基因集合是否在這個(gè)排序表的頂端或者底端富集嚣镜。
基因集富集分析檢測(cè)基因集合而不是單個(gè)基因的表達(dá)變化爬迟，因此可以包含這些細(xì)微的表達(dá)變化，預(yù)期得到更為理想的結(jié)果菊匿。
比較GO/KEGG等富集分析：
GO/KEGG差異基因的一刀切法——僅關(guān)注少數(shù)幾個(gè)顯著上調(diào)或下調(diào)的基因付呕，容易遺漏部分差異表達(dá)不顯著卻有重要生物學(xué)意義的基因，忽略一些基因的生物特性跌捆、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系及基因功能和意義等有價(jià)值的信息徽职。
GSEA不需要指定明確的差異基因閾值，算法根據(jù)實(shí)際整體趨勢(shì)分析佩厚。
3.MSigDB數(shù)據(jù)庫(kù)
http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb
定義了已知基因集姆钉，包括H和C1-C7八個(gè)系列（Collection/cluster），每個(gè)系列內(nèi)容為：
H: hallmark gene sets （效應(yīng)）特征基因集合，共50組潮瓶；
C1: positional gene sets 位置基因集合陶冷，根據(jù)染色體位置，共326個(gè)毯辅；
C2: curated gene sets：（專家）共識(shí)基因集合埂伦，基于通路、文獻(xiàn)等（包括KEGG）思恐；
C3: motif gene sets：模式基因集合沾谜，主要包括microRNA和轉(zhuǎn)錄因子靶基因兩部分；
C4: computational gene sets：計(jì)算基因集合胀莹，通過(guò)挖掘癌癥相關(guān)芯片數(shù)據(jù)定義的基因集合基跑；
C5: GO gene sets：Gene Ontology 基因本體論（包括BP/CC/MF）；
C6: oncogenic signatures：癌癥特征基因集合描焰，大部分來(lái)源于NCBI GEO 未發(fā)表芯片數(shù)據(jù)媳否；
C7: immunologic signatures: 免疫相關(guān)基因集合。
后續(xù)做分析時(shí)需要從中選擇感興趣的基因集栈顷。
4.分析過(guò)程
1）軟件下載（需java環(huán)境）
http://software.broadinstitute.org/gsea/downloads.jsp
2）設(shè)置
a. 準(zhǔn)備基因表達(dá)量矩陣文件：txt或gct（最好將基因名轉(zhuǎn)換為symbol，后續(xù)參數(shù)不用chip來(lái)轉(zhuǎn)化ID）
數(shù)據(jù)格式可參考：
http://www.broadinstitute.org/cancer/software/gsea/wiki/index.php/Data_formats
測(cè)試數(shù)據(jù)：
http://software.broadinstitute.org/gsea/datasets.jsp
b. 準(zhǔn)備說(shuō)明文件：cls
第一行：樣本數(shù)/分組數(shù)/always1
第二行：分組名
第三行：分組信息（我這里28個(gè)上部位嵌巷，21個(gè)下部位）
load data萄凤，成功會(huì)顯示
c. 選擇已知基因集（即以上8個(gè)cluster）
run GSEA，設(shè)置參數(shù)
Gene sets database：8個(gè)cluster及其分支搪哪，可多選
我這里選擇kegg和all GO靡努，若是想研究更多，可8個(gè)cluster全部選擇all晓折。
d. 設(shè)置參數(shù)：
Required fields
expression dataset：選擇表達(dá)量文件
number of permutations：置換次數(shù)惑朦，越大越好，但對(duì)計(jì)算有要求漓概，我選擇500
phenotype labels：選擇表型說(shuō)明文件cls
collapse dataset to gene symbols：若是gene symbols編號(hào)漾月，選擇false（我這里已經(jīng)提前轉(zhuǎn)換）,否則選擇true，即用chip來(lái)對(duì)ID轉(zhuǎn)換
permutation type：置換類型胃珍，#一般每組樣本數(shù)目大于7個(gè)時(shí)梁肿，建議選擇phenotype，否則選擇gene sets觅彰，官方文檔有說(shuō)明#吩蔑，我這里還是選擇gene_set
chip platform：和上面gene symbols參數(shù)對(duì)應(yīng)，不需轉(zhuǎn)換不用選擇填抬，否則選擇對(duì)應(yīng)的芯片
Basic fields
analysis name：項(xiàng)目名
save results in this folder：結(jié)果保存路徑
其他我都設(shè)置為默認(rèn)烛芬，沒(méi)有深加探索，可看官網(wǎng)，最后點(diǎn)run
GSEA運(yùn)行的原理可分為三步：1） 計(jì)算富集分?jǐn)?shù)（Enrichment Score赘娄，ES）仆潮；2） 估計(jì)富集分?jǐn)?shù)的顯著性水平；3） 矯正多重假設(shè)檢驗(yàn)擅憔。
完成后顯示：
5.結(jié)果解讀
保存文件路徑中生成一堆文件：
最惩疑粒看的是這種圖：
** 原理：**
根據(jù)所有基因在兩組樣本（case-control，我這里是upper-lower)的差異度量不同（共有六種差異度量暑诸，默認(rèn)是signal 2 noise蚌讼，GSEA官網(wǎng)有提供公式，也可以選擇大家熟悉的foldchange)个榕，根據(jù)差異度量大小排序篡石，并且Z-score標(biāo)準(zhǔn)化。圖中間的豎杠西采，就是每個(gè)gene set里的基因在所有排序好基因的位置凰萨，如果gene set里的基因集中在所有基因的前部分，就是在case里面富集械馆，如果集中在后面部分胖眷，就是在control里面富集著（結(jié)果中的熱圖就是豎杠的具象）。
我們一般關(guān)注ES值霹崎，峰出現(xiàn)在前端還是后端（ES值大于0在前端珊搀，小于0在后端）以及Leading-edge subset（即對(duì)富集貢獻(xiàn)最大的部分，領(lǐng)頭亞集）尾菇；在ES圖中出現(xiàn)領(lǐng)頭亞集的形狀境析，表明這個(gè)功能基因集在某處理?xiàng)l件下具有更顯著的生物學(xué)意義。
ES算法：
每個(gè)基因在gene set里的ES score取決于這個(gè)基因是否屬于該gene set及其差異度量派诬，上圖的差異度量就是FC（foldchange）,將每個(gè)gene set里的所有基因的ES score一個(gè)個(gè)加起來(lái)劳淆，叫running ES score，直到ES score達(dá)到最大值默赂，就是這個(gè)gene set最終的ES score沛鸵。
可以一一查看每個(gè)圖，也可點(diǎn)擊上面的GSEA reports查看success的網(wǎng)頁(yè)報(bào)告：
gsea_report報(bào)告結(jié)果中會(huì)有一個(gè)類似下圖的表格缆八，主要關(guān)注這三個(gè)部分：
標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)（NES）谒臼；
標(biāo)準(zhǔn)化顯著性水平（NOM p-val）；
矯正多重假設(shè)檢驗(yàn)（FDR q-val）耀里；
一般認(rèn)為NES絕對(duì)值≧ 1.0蜈缤，NOM p-val ≦ 0.05，F(xiàn)DR q-val ≦ 0.25是有意義的基因集合冯挎，當(dāng)然也要結(jié)合具體情況具體分析底哥。
如果英語(yǔ)好咙鞍，直接看官方文檔，很詳細(xì)：http://www.gsea-msigdb.org/gsea/doc/GSEAUserGuideFrame.html?_Interpreting_GSEA_Results
References：
https://mp.weixin.qq.com/s/NnRfeTLDb-42a8CV3kymZQ
http://www.bio-info-trainee.com/1282.html
http://www.bioinfo-scrounger.com/archives/557
ES算法：http://www.baderlab.org/CancerStemCellProject/VeroniqueVoisin/AdditionalResources/GSEA
