聲明：本文部分內(nèi)容和部分圖片來源于網(wǎng)絡(luò)梢睛。本文為生信小白學(xué)習(xí)筆記竹习，不能保證專業(yè)名詞和內(nèi)容全部正確或權(quán)威。
下圖為某一條RNAseq從數(shù)據(jù)預(yù)處理启涯，序列回帖到數(shù)據(jù)可視化的工作流程，包含了較多的軟件（Linux環(huán)境運(yùn)行）和若干個包（R語言環(huán)境運(yùn)行）恃轩，本系列將按下圖结洼，對每一個步驟進(jìn)行學(xué)習(xí)和理解。
某RNAseq分析方法
承接本RNAseq分析上一部分叉跛，F(xiàn)astQC可以得到較詳盡的測序結(jié)果質(zhì)量評估報告补君，并可以通過分析得到導(dǎo)致測序結(jié)果質(zhì)量較低的原因以利于下一步數(shù)據(jù)清洗和過濾。
Trimmomatic是2014年發(fā)表于Bioinformatics昧互，已經(jīng)引用19074次挽铁。主要針對Illumina平臺結(jié)果進(jìn)行分析伟桅，其他測序平臺可選擇相應(yīng)數(shù)據(jù)清洗軟件。
特點(diǎn)：Trimmomatic支持多線程叽掘，處理速度很快楣铁，主要用來去除 Illumina 平臺的 Fastq 序列中的接頭（adapter），并根據(jù)堿基質(zhì)量值對 Fastq 進(jìn)行修剪更扁。軟件有兩種過濾模式盖腕，分別對應(yīng) SE 和 PE 測序數(shù)據(jù)，同時支持 gzip 和 bzip2 壓縮文件浓镜。
簡單應(yīng)用
雙端測序
對于大部分測序數(shù)據(jù)溃列，都可以使用較溫和的質(zhì)量修整和接頭修剪。大部分情況下膛薛，不需要前端和末尾修剪（leading and traling clipping）听隐。通常，處理雙端測序文件哄啄，*keepBothReads*很有用雅任，這將保留多余的信息，但也會使分析流程更加可供處理咨跌。注意沪么，在*keepBothReads*前的2是指在palindrome模式的最小adapter長度，可以被設(shè)置為1（默認(rèn)值為8）锌半。
需要注意的是：Trimmomatic過濾數(shù)據(jù)的命令順序決定其過濾步驟禽车，為了更有效地去除接頭，可在其他過濾命令前刊殉，第一步就去除哭当。
java -jar trimmomatic-0.35.jar PE -phred33 input_forward.fq.gz input_reverse.fq.gz output_forward_paired.fq.gz output_forward_unpaired.fq.gz output_reverse_paired.fq.gz output_reverse_unpaired.fq.gz ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36
不同命令的功能：
- 移除接頭（ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10）
- 移除前端低質(zhì)量序列或N堿基（低于質(zhì)量3）（LEADING:3）
- 移除尾端低質(zhì)量序列或N堿基（低于質(zhì)量3）（TRAILING:3）
- 使用4堿基寬度的滑窗掃描讀段，當(dāng)每堿基平均質(zhì)量低于15時冗澈，進(jìn)行修剪（SLIDINGWINDOW:4:15）
- 去除長度小于36堿基的讀段（MINLEN:36）
單端測序
命令參數(shù)：
java -jar trimmomatic-0.35.jar SE -phred33 input.fq.gz output.fq.gz ILLUMINACLIP:TruSeq3-SE:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36
這段命令具體功能見雙端測序钦勘。
Trimmomatic介紹
針對Illumina雙端測序和單端測序，Trimmomatic呈現(xiàn)了多種有用的修剪工具亚亲。修剪步驟的選擇及其相關(guān)的參數(shù)可在命令行上實現(xiàn)彻采。
現(xiàn)有的修剪步驟：
ILLUMINACLIP：從讀段中，修剪接頭和其他Illumina特有的序列捌归。
SLIDINGWINDOW：提供了一個滑窗修剪工具肛响，一旦在該窗口的平均質(zhì)量低于某個閾值，即刪除該堿基惜索。
LEADING：減去低于質(zhì)量閾值的讀段首端特笋。
TRAILING：減去低于質(zhì)量閾值的讀段末端。
CROP：將讀段剪切為特定的長度
HEADCROP：從讀段的首端減去特定長度的堿基巾兆。
MINLEN：如果低于一定長度猎物，刪除該讀段虎囚。
TOPHRED33：將質(zhì)量分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)換為Phred-33
-
TOPHRED64：將質(zhì)量分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)換為Phred-64
對單端測序，需要指定一個輸入和一個輸出文件蔫磨，加上相應(yīng)的處理步驟淘讥；對雙端測序文件，需要指定兩個輸入文件和四個輸出文件堤如，其中兩個為‘paired’輸出文件（包含一對均經(jīng)過篩選后留下的讀段）和兩個相應(yīng)的‘unpaired’輸出文件（包含僅有一個讀段成功經(jīng)過篩選）蒲列。
Trimmomatic運(yùn)行
雙端模式
java -jar <path to trimmomatic.jar> PE [-threads <threads] [-phred33 | -phred64] [-trimlog <logFile>] <input 1> <input 2> <paired output 1> <unpaired output 1> <paired output 2> <unpaired output 2> <step 1> ...
或
java -classpath <path to trimmomatic jar> org.usadellab.trimmomatic.TrimmomaticPE [-threads <threads>] [-phred33 | -phred64] [-trimlog <logFile>] <input 1> <input 2> <paired output 1> <unpaired output 1> <paired output 2> <unpaired output 2> <step 1> ...
單端模式
java -jar <path to trimmomatic jar> SE [-threads <threads>] [-phred33 | -phred64] [-trimlog <logFile>] <input> <output> <step 1> ...
或
java -classpath <path to trimmomatic jar> org.usadellab.trimmomatic.TrimmomaticSE [-threads <threads>] [-phred33 | -phred64] [-trimlog <logFile>] <input> <output> <step 1> ...
