Identification of Therapeutic Targets in Rhabdomyosarcoma through Integrated Genomic, Epigenomic, and Proteomic Analyses

通過整合的基因組，表觀基因組和蛋白質(zhì)組學分析確定橫紋肌肉瘤的治療靶標

期刊：Cancer Cell；影響因子：26.602

發(fā)表單位：圣裘德兒童研究醫(yī)院等?

導(dǎo) 讀

????橫紋肌肉瘤（RMS）是一種在骨骼肌中發(fā)生的侵襲性小兒癌癥秉氧，但目前仍缺乏有效的靶向藥物。2018年8月發(fā)表在《Cancer Cell》的一項研究中芹枷，通過對RMS的兩種模型（肺泡RMS和胚胎RMS）進行基因組、表觀基因組和蛋白質(zhì)組學的聯(lián)合分析揭示了可能的治療靶點离福。研究發(fā)現(xiàn)表明杖狼，RMS細胞在各種途徑（包括RAS–MEK–ERK–CDK4/6途徑，未折疊的蛋白反應(yīng)途徑和有絲分裂檢查點途徑）中均具有異逞活性。在測試的各種藥物中理朋，化學療法與激酶WEE1抑制劑（干擾有絲分裂檢查點）的組合最有效地阻止了小鼠原位患者來源的異種移植物的生長絮识。此外，表觀基因組和基因組分析表明嗽上，沿著肌肉發(fā)育程序的肺泡RMS比胚胎RMS出現(xiàn)得更多次舌，為具有這些不同類型RMS的患者揭示了可能有用的診斷標記和其他靶標。這些發(fā)現(xiàn)可能導(dǎo)致針對RMS患者的針對性更強兽愤、亞型特異性的療法彼念。

摘 要

????針對患者腫瘤中體細胞突變的個性化癌癥治療越來越多地納入實踐。由于腫瘤特異性表觀遺傳干擾而引起的基因表達變化所導(dǎo)致的其他治療弱點正在逐漸被認識到浅萧，這些基因組和表觀基因組的變化最終在腫瘤蛋白組和磷蛋白組中表現(xiàn)出來逐沙。本研究整合了轉(zhuǎn)錄組、外基因組洼畅、蛋白質(zhì)組/磷蛋白組數(shù)據(jù)來闡明橫紋肌肉瘤（RMS）的細胞起源和治療弱點吩案。研究發(fā)現(xiàn)肺泡RMS在發(fā)育過程中比胚胎RMS發(fā)生得更遠，并確定了RAS/MEK/ERK/CDK4/6帝簇、G2/M以及未折疊蛋白反應(yīng)途徑的失調(diào)徘郭。全面的臨床前測試表明靠益，靶向G2/M途徑中的WEE1激酶是體內(nèi)高風險RMS的最有效方法。

前 言

????橫紋肌肉瘤（RMS）是一種兒童時期的實體瘤残揉，具有骨骼肌特征胧后，主要分為胚胎性橫紋肌肉瘤（ERMS）和腺泡型橫紋肌肉瘤（ARMS）兩種亞型。大約75％的局部疾病患者可通過常規(guī)的多模式療法治愈抱环，但復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性疾病的患者總生存率分別為17％和30％壳快。由于RMS患者的整體生存率在過去15年中沒有顯著提高，迫切需要開發(fā)RMS的新型治療方法江醇。為了增進對復(fù)發(fā)性RMS的理解并提供更多的臨床前模型濒憋，本研究建立了原位患者源性小兒實體瘤異種移植物（O-PDX）的集合，并聯(lián)合基因組陶夜、表觀基因組凛驮、轉(zhuǎn)錄組、定量蛋白質(zhì)組以及磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)以全面闡述RMS的細胞起源以及治療靶點条辟。

研究概要

1? ??橫紋肌肉瘤的表觀遺傳學分析

????針對RMS患者以及原位人源腫瘤異種移植（O-PDX）的腫瘤組織WGBS和RNA-Seq結(jié)果顯示黔夭，大多數(shù)患者腫瘤和匹配的O-PDX與基因表達和DNA甲基化相關(guān)，并且腫瘤類型之間的差異與患者腫瘤中浸潤的非腫瘤細胞有關(guān)羽嫡。在緊接啟動子下游的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了許多與DNA甲基化和mRNA表達呈負相關(guān)的基因本姥，而在整個基因座中發(fā)現(xiàn)了許多與DNA甲基化和mRNA表達呈正相關(guān)的基因，并包含部分甲基化的結(jié)構(gòu)域杭棵。差異表達和甲基化基因的通路分析表明婚惫，負相關(guān)的基因主要是胚胎骨骼肌發(fā)育的介質(zhì)，而正相關(guān)的基因則主要是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的介質(zhì)魂爪。

????進一步對O-PDX腫瘤先舷、成肌細胞、肌管及骨骼肌進行ChIP-seq滓侍，聯(lián)合基因表達及DNA甲基化全面描繪表觀基因組圖譜蒋川，并對數(shù)據(jù)執(zhí)行染色質(zhì)隱性馬爾可夫建模（chromHMM）。在ERMS中上調(diào)的基因包含ERMS特異性超級增強子撩笆，表觀遺傳上調(diào)的基因參與細胞外基質(zhì)的組織和胚胎的形態(tài)發(fā)生捺球，特別是四肢和骨骼系統(tǒng)的形成；在ARMS中上調(diào)的基因包含ARMS特異性超級增強子夕冲，其中許多與肌發(fā)生有關(guān)氮兵，表觀遺傳上調(diào)了參與肌肉分化的基因，這表明它在肌肉發(fā)育的后期被阻止耘擂。

圖2胆剧，相對于啟動子/增強子活性的表觀遺傳學差異。（A）代表性18個chromHMM狀態(tài)的熱圖；（B）描繪了ERMS和ARMS中18個chromHMM狀態(tài)在基因組注釋區(qū)域中所占的比例秩霍；（C）MYOG的ChIP-seq峰和chromHMM篙悯；（D-F）分別為在ERMS中選擇性表達的GAS2（D），在ARMS中選擇性表達的NOS1（E）铃绒，以及在成肌細胞中選擇性表達的AXL（F）鸽照；（G）相對于ARMS，ERMS中上調(diào)或下調(diào)的基因的維恩圖颠悬。

2? ??橫紋肌肉瘤蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組的定量分析

????對12個O-PDX以及人成肌細胞和成肌管的蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組進行定量矮燎，鑒定了16523個蛋白質(zhì)和62965個磷酸化事件。主成分分析顯示不同樣本類型呈現(xiàn)明顯分離赔癌。通過對肌細胞與肌管和RMS之間差異表達的蛋白質(zhì)和磷蛋白的功能分析诞外，確定了對肌發(fā)生重要的幾種途徑，包括Wnt灾票、HH峡谊、PI3K、p38/MAPK刊苍、BMP和腺苷酸環(huán)化酶既们。MYOG是與肌肉分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，與ERMS相比正什，ARMS表達的MYOG mRNA和蛋白水平更高啥纸，這表明其表達是分級的。MYF5在成肌過程中由成肌細胞瞬時表達婴氮，相對于肌肉斯棒，所有ARMS均表達較低水平的MYF5，而一部分ERMS則顯示較高水平的MYF5 mRNA和蛋白質(zhì)主经。MYF5和MYOG蛋白表達在大多數(shù)RMS中呈負相關(guān)名船，并以相同的模式激活MYOG轉(zhuǎn)錄靶基因。

圖3旨怠，分析橫紋肌肉瘤蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組。（A）RMS腫瘤蜈块、肌管和成肌細胞的蛋白質(zhì)組學和磷酸化蛋白質(zhì)組學分析的工作流程鉴腻；（F、G）成肌細胞百揭、肌管ERMS和ARMS的蛋白質(zhì)組（F）和磷酸蛋白質(zhì)組（G）的主成分分析爽哎；（J）對MYOG和MYF5進行蛋白質(zhì)組學分析得出的Log 10蛋白表達強度的散點圖；（K）對每種O-PDX腫瘤的MYOG和MYF5樣品的代表性免疫染色和MYOG和MYF5免疫陽性細胞百分數(shù)的散點圖器一。

3? ??使用多個平臺的集成分析

????作者隨后通過腫瘤中差異表達的蛋白質(zhì)和mRNA课锌，并整合了保守的基因/蛋白質(zhì)進行了共表達聚類，獲得4個蛋白質(zhì)簇（IPC）。IPC1包含相對于成肌細胞在腫瘤中上調(diào)的基因/蛋白質(zhì)渺贤，IPC2包含ERMS中上調(diào)的基因/蛋白質(zhì)雏胃，IPC3包含ARMS中上調(diào)的基因/蛋白質(zhì)，IPC4包含的基因/蛋白質(zhì)相對于成肌細胞在腫瘤中被下調(diào)志鞍。作者還對每個IPC進行蛋白網(wǎng)絡(luò)的通路分析瞭亮，并將轉(zhuǎn)錄組學、表觀基因組學固棚、蛋白質(zhì)組學和磷酸化蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)與順序統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行了整合统翩。MYOG是ARMS中排名最高的基因/蛋白質(zhì)之一，而MYF5在ERMS中排名最高此洲。相對于ERMS厂汗，ARMS中最上調(diào)的途徑是肌生成。觀察到ARMS和ERMS之間NOS1 mRNA /蛋白的差異表達呜师，NOS1在ARMS中排名最高娶桦。還確定了ARMS和ERMS中相對于成肌細胞的G2/M和E2F目標上調(diào)。

圖4匣掸，轉(zhuǎn)錄組趟紊、表觀遺傳學和蛋白質(zhì)組/磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的整合碰酝。（A）基于差異表達聚類和PPI網(wǎng)絡(luò)模塊的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整合方案送爸；（C）通路富集熱圖袭厂，用于分析每個IPC中的基因/蛋白質(zhì)纹磺；（E）G2/M檢查點模塊的放大圖橄杨，顯示了代表性的基因/蛋白質(zhì)式矫。

4? ??靶向橫紋肌肉瘤中的RAS-CDK4/6途徑

????作者分析了患者種系組織采转、RMS和匹配的O-PDX的WGS和WES數(shù)據(jù)板熊，在RMS中發(fā)現(xiàn)了18個在具有致病性癌癥突變的基因。相對于成肌細胞丹泉，RAS摹恨、mTORC1和PI3K-AKTmTOR信號傳導(dǎo)途徑的RMS失調(diào)晒哄，并發(fā)現(xiàn)這些路徑下游E2F靶標的失調(diào)。表觀遺傳學分析證實E2F轉(zhuǎn)錄靶標如CDK1在RMS中被激活较木，蛋白質(zhì)組/磷酸化和免疫組化染色數(shù)據(jù)表明cyclin D/CDK4/6-RB/E2F途徑在O-PDX中活躍伐债。隨后，作者測試了抑制RAS-CDK4/6途徑是否有助于治療RMS虹蒋，發(fā)現(xiàn)MEK抑制劑與CDK4/6抑制劑的組合可協(xié)同降低癌細胞的存活率，然而體內(nèi)靶向RAS-CDK4/6途徑卻無效邪驮。

圖5盘榨，針對橫紋肌肉瘤中的RAS和CDK4/6草巡。（A）RAS和CDK4/6途徑的簡化途徑圖山憨；編碼蛋白質(zhì)的基因經(jīng)常發(fā)生突變，用紫色和粗體標出棚亩，用小分子抑制劑靶向虏杰；（D）代表性ERMS和ARMS腫瘤切片H&E染色或cyclin D2（ERMS）瘸彤、cyclin D3（ARMS）和phosphoRB1（pRB1）免疫組化染色钧栖；（G拯杠、H）通過生物發(fā)光隨時間變化測量O-PDX腫瘤負荷的代表性圖（G）依溯，以及palbociclib+trametinib治療組PD小鼠的圖像（H）黎炉。

5? ??靶向橫紋肌肉瘤中的G2/M和未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）途徑

????因為在體內(nèi)靶向RAS-CDK4/6途徑無效淀弹，并且RMS中幾乎沒有可藥用的突變，作者試圖通過集成數(shù)據(jù)集鑒定與治療相關(guān)的腫瘤易感性沐序。分析發(fā)現(xiàn)，靶向UPR和G2/M檢查點途徑的HSP90抑制劑ganetespib（GSP）和WEE1抑制劑AZD1775顯示出顯著的體外活性垄惧。許多HSP90靶標是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。熱休克轉(zhuǎn)錄因子HSF1的過度磷酸化是細胞應(yīng)激的標志滤钱，發(fā)現(xiàn)HSF1的蛋白質(zhì)水平和磷酸化增強以及RMS腫瘤中的HSF1靶基因表達，GSP處理細胞可以迅速誘導(dǎo)HSP70和其他HSF1靶基因的表達。使用對加性相互作用劑量模型的雙變量響應(yīng)分析每種藥物組合的作用，發(fā)現(xiàn)GSP增強了化療誘導(dǎo)的O-PDX細胞死亡盒件。WEE1在細胞周期中調(diào)節(jié)G2/M檢查點和DNA復(fù)制。相對于成肌細胞片吊，RMS的表觀遺傳學全谤、基因表達和蛋白質(zhì)組/磷酸化數(shù)據(jù)揭示了該途徑的上調(diào)补憾。用AZD1775處理RMS細胞系會導(dǎo)致G2/M期停滯，這表明WEE1和HSP90均可能是RMS的可治療目標。

圖6叙凡，針對橫紋肌肉瘤中的HSP90。（A）RMS中由HSP90調(diào)節(jié)的六個成肌途徑；（E）HSF1靶基因（HSPA1A）的ChromHMM和通過RNA-seq（FPKM）的相應(yīng)基因表達漓柑；（F）受試藥物的有效濃度的熱圖；（G）GSP或IRN+VCR處理后叨吮，細胞中HSP70表達的免疫印跡辆布。

6? ??體內(nèi)靶向G2/M和UPR途徑

????作者最后對靶向G2/M通路進行了體內(nèi)試驗評估。通過O-PDX荷瘤小鼠進行1茶鉴、2锋玲、3期臨床前藥代動力學實驗實驗，使用GSP以及AZD1775與標準治療藥物聯(lián)合給藥涵叮，結(jié)合小鼠腫瘤大小變化及生存期進行評估惭蹂，結(jié)果表明G2/M通路上WEE1激酶是治療高風險RMS的最有效作用靶點伞插。AZD1775+VCR+IRN治療有70%（26/37）表現(xiàn)為完全響應(yīng)（CR）或部分響應(yīng)（PR ）， AZD1775+IRN為39%（14/36）CR+PR 盾碗。

圖8媚污，AZD1775和Ganetespib的臨床前測試。（A）使用O-PDX的原代培養(yǎng)物對GSP和AZD1775的劑量反應(yīng)曲線廷雅；（B）O-PDX腫瘤（藍色）和血漿（紅色）中GSP的PK圖耗美；（F）AZD1775組和GSP+IRN+VCR組的小鼠及其腫瘤的代表圖像；（H）治療組小鼠的生存曲線航缀。

討 論

????為了跨越基因組分析的局限并確定可能在RMS中失調(diào)的基本途徑商架，本研究進行了綜合轉(zhuǎn)錄組學、表觀遺傳學和蛋白質(zhì)組學/磷酸化分析芥玉。研究確定了UPR和G2/M有絲分裂紡錘體檢查點途徑是RMS綜合分析中變化最大的途徑蛇摸。觀察到RMS細胞系和O-PDX對GSP的敏感性高于其他小兒實體瘤，對WEE1的抑制也是如此灿巧。GSP+VCR+IRN在臨床前1期研究中耐受性良好赶袄，在2期研究中部分有效，該發(fā)現(xiàn)可能為高風險RMS患者的未來臨床試驗提供依據(jù)砸烦。根據(jù)廣泛的3期臨床前研究弃鸦，研究強調(diào)將VCR與AZD1775和IRN結(jié)合使用，以提高RMS患者發(fā)生反應(yīng)的可能性幢痘。