? ? ? ? 角膜位于眼球最前端迫皱，占有眼球2/3的屈光度。角膜是透明的辖众，具有層狀結(jié)構(gòu)卓起。角膜透明是由于基質(zhì)膠原纖維的特殊排列和沒有血管。由于沒有血管凹炸，角膜和臨近組織中促血管生成因子和抗血管生成因子的動態(tài)平衡戏阅，保持角膜無血管生成，使其為免疫赦免器官啤它。幾類因素可能觸發(fā)此種平衡失衡奕筐，促血管發(fā)生和/或抗血管生成因子降低，導(dǎo)致角膜新生血管变骡。形成角膜新生血管（cornealneovascularization, CNV）的原因可以是先天性的离赫，如無虹膜；或獲得的塌碌，如外傷渊胸，感染，炎癥誊爹，變性等蹬刷，這些因素通過不同機(jī)制誘導(dǎo)新血管形成，大多數(shù)包括缺氧频丘，炎癥和角膜緣干細(xì)胞缺乏等办成。時至今日，CNV確切的機(jī)制尚不清楚搂漠，然而迂卢，幾種炎癥介導(dǎo)因子和生長因子進(jìn)入人們視線，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascularendothelial growth factor, VEGF）家族是新血管形成和生長的關(guān)鍵因素之一。VEGF分為幾種亞型因子而克，VEGF-A在血管生成中是最重要的礁击。負(fù)責(zé)血管生成的其他因素建车，包括血小板衍生的生長因子（PDGF）契耿，堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）犀盟，某些白細(xì)胞介素和細(xì)胞因子等。它們的作用仍然是不明確的碎绎◇θ溃基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）可以破壞細(xì)胞外基質(zhì)，并促進(jìn)生成新血管筋帖。MMP-2和MMP-9在角膜新生血管向內(nèi)生長中起重要作用奸晴，可作為治療靶點。全世界約有一千萬人因角膜原因失明日麸，是繼白內(nèi)障后的第二個可逆性失明的常見原因寄啼。由于生活、衛(wèi)生條件差和治療費用昂貴等原因代箭，角膜失明是在發(fā)展中國家更為常見墩划。與視網(wǎng)膜變性和青光眼等疾病不同，角膜失明是可以預(yù)防的梢卸，大多數(shù)都是可逆的走诞。改進(jìn)已有治療方法和研究新的治療手段可有效減少因角膜失明的患者。此外提高人群受教育程度蛤高，改進(jìn)生活條件將減少因角膜受累而失明的概率。臨床用于CNV的療法分為兩類：藥物治療和手術(shù)治療碑幅。藥物包括類固醇或非類固醇消炎藥物戴陡。近期，抗VEGF因子在治療眼部新生血管中得到廣泛應(yīng)用沟涨，包括CNV的治療恤批，收到了良好的治療效果，但許多國家尚未批準(zhǔn)應(yīng)用此類藥物裹赴。一些生物材料治療和基因治療在實驗中展開喜庞，但尚未應(yīng)用到臨床。手術(shù)治療包括激光光凝棋返，光動力療法延都，電凝固術(shù)和移植療法。移植物包括角膜的全層或單層睛竣，羊膜晰房，結(jié)膜，種植口腔粘膜上皮片或角膜緣干細(xì)胞。角膜緣干細(xì)胞移植主要用于角膜緣干細(xì)胞缺乏和角膜新生血管的治療殊者，有較高成功率与境。第一次開展角膜緣干細(xì)胞移植手術(shù)是將來自健眼的角膜緣小片移植到對側(cè)傷眼切口處。現(xiàn)在這種技術(shù)經(jīng)改善后已經(jīng)實施猖吴，包括角膜緣干細(xì)胞擴(kuò)增和借助羊膜摔刁，生物支架載體或隱形眼鏡等進(jìn)行移植，臨床試驗已對此項技術(shù)的安全性海蔽，可行性和有效性進(jìn)行調(diào)查共屈。角膜緣干細(xì)胞移植治療CNV雖是一種有效方法，但仍有許多弊端准潭，如：需手術(shù)才可得到角膜緣小片趁俊，所以有炎癥和感染等并發(fā)癥；很多眼部新生血管是雙側(cè)發(fā)病刑然，得到有用的角膜緣小片組織十分困難寺擂。而異體移植又有高免疫排斥風(fēng)險，尤其對于免疫赦免已經(jīng)破壞的角膜泼掠。由于以上諸多原因怔软，大家不斷提出新的治療方案，干細(xì)胞移植可能是其中最適合有效的方法择镇。干細(xì)胞是具有自我更新和分化能力的細(xì)胞挡逼。主要有三種類型：胚胎干細(xì)胞（ESC），成體干細(xì)胞腻豌，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPS）家坎。IPS和ESC生長較快，多潛能吝梅，在適當(dāng)?shù)拇碳l件下可以分化為多種細(xì)胞虱疏，但由于許多實際問題，限制在臨床使用苏携。如：倫理問題做瞪，免疫排斥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生的風(fēng)險高。對比ESC和iPS右冻，MSCs是一種在體外分離培養(yǎng)簡單装蓬，再生能力強(qiáng)，腫瘤形成風(fēng)險低纱扭，不面臨倫理問題牍帚，更適合于干細(xì)胞治療。已經(jīng)有許多研究表明跪但，這些細(xì)胞具有良好的可塑性履羞，致瘤率低峦萎。因此，它們更適用于移植治療忆首。間充質(zhì)干細(xì)胞可以從多種器官和組織中分離出來爱榔，如：骨髓，脂肪組織糙及，牙齒和羊水详幽，臍帶，胎盤等浸锨。最常使用的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）唇聘。它們具有以下特征：從骨髓中分離，貼壁生長柱搜，紡錘形細(xì)胞迟郎，表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD105，CD90聪蘸，CD29宪肖，不表達(dá)CD31，CD45健爬，CD11b等控乾。MSCs可提供神經(jīng)營養(yǎng)因子，但其整合和分化的能力始終還面臨問題娜遵。BMSCs適宜自體移植蜕衡。最近的研究表明，骨BMSCs不表達(dá)MHC II類抗原设拟，共刺激分子CD80慨仿，CD84或CD40和僅表達(dá)少量MHC I類抗原，因此纳胧，他們可以對接受者免疫系統(tǒng)是無形的镶骗。這使干細(xì)胞在自體和異體移植中廣泛應(yīng)用。MSC本身還通過抑制T細(xì)胞躲雅，B細(xì)胞和NK細(xì)胞活性抑制免疫系統(tǒng)。從脂肪組織骡和，臍帶相赁，羊水和骨髓衍生的MSC顯示出大致相同的特性，所以細(xì)胞移植可以從醫(yī)療廢物（吸脂慰于，胎盤钮科，臍帶（UC）和分娩后羊水）獲得，并安全地用于自體移植婆赠。2005-2006年有報告使用MSCs治療角膜新生血管绵脯。在此之后，許多研究團(tuán)隊開始探討充質(zhì)干細(xì)胞在角膜傷口愈合和角膜血管生成中的作用。至少有35篇發(fā)表的報告出現(xiàn)蛆挫。所有發(fā)表的論文均報告間充質(zhì)干細(xì)胞有利于角膜傷口愈合和減少角膜上皮修復(fù)時間赃承。研究目的：進(jìn)一步研究骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞在角膜新生血管形成和傷口愈合中的作用，并比較不同治療途徑的可行性和有效性悴侵。材料和方法：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來自8日齡Wistar大鼠瞧剖，體外培養(yǎng)，分離可免。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測表面標(biāo)志物抓于。第二或第三代細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記。在健康孕婦在知情同意后浇借，獲得人羊膜捉撮。通過化學(xué)和機(jī)械方法去除上皮層得到（denuded human amniotic membranes，d-HAM)妇垢，BMSCs接種到d-HAM上巾遭。共36只雌性Wistar大鼠利用化學(xué)傷害誘導(dǎo)法建立角膜新生血管動物模型。動物右眼角膜的中心浸泡在被1mol/L的氫氧化鈉水溶液（NaOH）浸濕的直徑3mm濾紙30秒修己，接著用60ml無菌鹽水對角膜徹底沖洗1分鐘恢总。七天后大鼠隨機(jī)分為三組：第一組接受結(jié)膜下注射溶于PBS中的BMSCs，第二組接受接種BMSCs的D-HAM移植睬愤，第三組未接受治療片仿，作為對照組。角膜上皮缺損面積尤辱，基質(zhì)水腫和沉著混濁形成砂豌，新生血管面積用于評價角膜損傷。每天利用直接檢眼鏡并每周通過裂隙燈觀察光督。四個星期后處死動物阳距。每組五個角膜用于墨汁灌注后鋪片，圖片進(jìn)行特殊軟件處理结借，計算新生血管總長度筐摘。每組四個角膜提取RNA，利用定量實時聚合酶鏈反應(yīng)（Q-PCR）檢測VEGF-A的船老，MMP9咖熟， TLR-2和TLR-4表達(dá)量。各組中兩個角膜通過酶聯(lián)免疫分析（ELISA）用于VEGF的檢測柳畔，每組中的一個角膜馍管，做冷凍切片，用于進(jìn)一步的組織病理學(xué)和對VEGF和MMP9的免疫染色薪韩。結(jié)果：48h后确沸，分離培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞清晰可見捌锭。傳代至第二代和第三代顯示間充質(zhì)干細(xì)胞的典型特征：貼壁生張，紡錘狀罗捎，流式細(xì)胞術(shù)顯示CD90和CD44的陽性表達(dá)观谦， CD45和CD11b不表達(dá)。細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)GFP慢病毒宛逗，倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞呈綠色熒光坎匿。通過DAPI染色和激光共聚焦顯微鏡證實羊膜上皮層已剝脫。同樣證實BMSCs可在D-HAM成長雷激。大鼠造模七天后檢查可見角膜混濁替蔬，新生血管生長，并用熒光染料證實上皮缺損屎暇。檢測每個組損傷程度承桥，單因素方差分析結(jié)果顯示組（P=103，CI95％）無顯著區(qū)別根悼。四星期后得到的結(jié)果凶异，通過ANOVA再次進(jìn)行比較。該分析顯示挤巡，組（P=0.002剩彬，CI=95％），統(tǒng)計學(xué)差異顯著矿卑，差異在1組和2組喉恋，1組和3組和之間。2組和3組之間沒有顯著差異母廷。因此轻黑，單一結(jié)膜下注射BMSCs與使用羊膜作為載體移植BMSCs相比，前者對角膜傷口愈合的影響更大琴昆。墨汁灌注圖片表明氓鄙，第2組和第3組與第1組相比，新生血管區(qū)域和長度更加明顯（P=0.01业舍，CI為95％）抖拦。用角膜部分H-E染色顯示，第1組角膜變薄舷暮，基質(zhì)緊湊蟋座，炎性細(xì)胞浸潤少，上皮層完全康復(fù)脚牍。DAPI和抗VEGF和抗MMP9抗體免疫染色無明顯表達(dá)。ELISA試劑盒用于半定量檢測VEGF巢墅。Q-PCR檢測VEGF诸狭，MMP9和TLR2和TLR4券膀。統(tǒng)計分析表明，各因素組間有差異驯遇，但僅限于VEGF的表達(dá)有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.03芹彬，CI=95％）。討論：角膜病致盲叉庐，是可逆性致盲眼病中第二常見原因舒帮，世界范圍內(nèi)對社會的經(jīng)濟(jì)和心理產(chǎn)生影響。數(shù)百萬計的患者都是雙側(cè)角膜受累致盲陡叠，發(fā)展中國家人數(shù)比例更多玩郊。然而角膜失明即使在發(fā)達(dá)國家也十分嚴(yán)重。許多國際組織枉阵，包括世界衛(wèi)生組織（WHO）都已提出改善這種情況戰(zhàn)略译红。研究者正改善目前的治療方式和并尋找新的治療方法。其中包括在角膜新生血管治療中應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞兴溜。許多團(tuán)體都已開展這項治療侦厚，報告了滿意的效果。我們研究的目的是為了進(jìn)一步探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對角膜新生血管的作用拙徽，并以比較幾個不同移植途徑的效果刨沦。我們利用化學(xué)燒傷角膜造模，單純結(jié)膜下注射BMSCs和以裸露羊膜為載體膘怕，接種BMSCs后移植相比較想诅，之前無相關(guān)報告的。我們的主要評估細(xì)胞移植后臨床效果及其對新生血管形成的影響淳蔼。我們的研究表明侧蘸，移植干細(xì)胞可增強(qiáng)角膜傷口愈合和減少新生血管生成。令人驚奇的是鹉梨，簡單結(jié)膜下注射的BMSCs與羊膜接種干細(xì)胞移植相比讳癌，前者更有效。我們分析存皂，這種差異可能是因為羊膜存在于角膜表面晌坤，4天后大多數(shù)羊膜已溶解消失，不能作為干細(xì)胞的載體繼續(xù)發(fā)揮作用旦袋，所以干細(xì)胞失去載體后不能持久的固定在眼表上骤菠，故不能繼續(xù)發(fā)揮作用。干細(xì)胞是否分化為角膜細(xì)胞不是我們的此次研究的重點疤孕，我們雖然應(yīng)用慢病毒GFP標(biāo)記跟蹤移植細(xì)胞的運動商乎。然而移植四個星期后，我們無法檢測到GFP標(biāo)記細(xì)胞祭阀，所以未發(fā)現(xiàn)角膜有任何移植細(xì)胞鹉戚。所以BMSCs可能通過局部釋放營養(yǎng)因子發(fā)揮抗炎效果及抑制新生血管作用鲜戒。結(jié)膜下注射后VEGF和MMP9的表達(dá)水平也表現(xiàn)出顯著降低。而對于TLR-2和TLR-4的差異不顯著抹凳，由于未見相關(guān)研究的報道遏餐，我們得出的結(jié)果可能與觀察的時間點有關(guān)。TLR是負(fù)責(zé)免疫反應(yīng)赢底，其表達(dá)在炎癥開始的階段增加明顯失都。四周后的炎癥已在所有組中顯著降低，可能此時Toll樣受體的水平已降低到正常水平幸冻，所以我們未檢測到干細(xì)胞治療對它的具體影響粹庞。結(jié)論：BMSCs移植能夠有效抑制角膜新生血管，單純結(jié)膜下注射BMSCs比羊膜接種BMSCs后移植更有效嘁扼。