1.引物設(shè)計(jì)的基本原則是什么女仰？
- 引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)御毅。
- 引物長(zhǎng)度一般在15-30堿基之間智听。
- 引物GC含量在40%-60%之間袱院，Tm值最好接近72 ℃。
- 引物3’端要避開(kāi)密碼子的第3位瞭稼。
- 引物3’端不能選擇A忽洛，最好選擇T。
- 堿基要隨機(jī)分布环肘。
- 引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列欲虚。
- 引物5’端和中間△G值應(yīng)該相對(duì)較高，而3’端△G值較低悔雹。
- 引物的5’端可以修飾复哆，而3’端不可修飾。
- 擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)腌零。
- 引物應(yīng)具有特異性梯找。
2.Tm值：
- Tm值的概念：DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時(shí)的溫度益涧，亦即DNA 變性過(guò)程中锈锤，紫外吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為 DNA 的解鏈溫度(Tm)。
- 長(zhǎng)度為20 mer及以下的引物闲询，Tm計(jì)算公式為： Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)久免。但這個(gè)公式只適用于14~20個(gè)堿基的引物，引物的TM值還與引物長(zhǎng)度扭弧、堿基組成阎姥、引物使用緩沖溶液的離子強(qiáng)度等有關(guān)。
對(duì)于更長(zhǎng)的寡聚核苷酸鸽捻，Tm計(jì)算公式為： Tm = 0.41(% of GC) – 675/L + 81.5
注：L：引物堿基數(shù)呼巴；% of GC：引物GC含量；% of GC = GC個(gè)數(shù)/引物總堿基數(shù)
3.常見(jiàn)引物修飾
| 修飾 | 說(shuō)明 |
|---|---|
| 磷酸化Phosphorylation | 5'磷酸化可用于接頭御蒲、克隆和基因構(gòu)建以及連接酶催化的連接反應(yīng)衣赶。3'磷酸化可抗3'外切酶消化的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸反應(yīng)删咱。 |
| 生物素Biotin | 引物生物素標(biāo)記屑埋，可用于非放射性免疫分析來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)、胞內(nèi)化學(xué)染色痰滋、細(xì)胞分離摘能、核酸分離续崖、雜交檢測(cè)特異性的DNA/RNA序列、離子通道構(gòu)象變化等团搞。 |
| 地高新Digoxigenin | 地高新經(jīng)由一個(gè)11個(gè)原子的間臂連接到脲嘧啶的C5位置严望，雜交的地高新探針可以由抗地高新抗體來(lái)檢測(cè)。地高新標(biāo)記的探針可用于各種雜交反應(yīng)逻恐，如DNA-DNA雜交（Southern blotting）像吻、DNA-RNA雜交（Northern blotting）、斑點(diǎn)雜交（Dot blotting）复隆、克隆雜交拨匆、原位雜交以及酶聯(lián)免疫分析（ELISA）。 |
| 內(nèi)部氨基修飾 | 主要用C6-dT aminolinker來(lái)加到胸腺嘧啶殘基上來(lái)進(jìn)行內(nèi)部修飾挽拂。修飾后氨基與主鏈相距10個(gè)原子距離惭每，可用于進(jìn)一步的標(biāo)記和酶連接（如堿性磷酸酶），目前提供內(nèi)部氨基修飾介導(dǎo)的dT-Dabcyl亏栈、dT-Biotin和dT-Digoxingenin 修飾台腥。 |
| 5'氨基修飾 | 可用于制備功能化的寡核苷酸，廣泛應(yīng)用在DNA芯片（DNA Microarray）和多重標(biāo)記診斷系統(tǒng)绒北。目前提供5' C6 氨基修飾和5' C12氨基修飾兩種黎侈，前者可用于連接一些即便靠近寡核苷酸也不會(huì)影響其功能的化合物，后者用于親和純化基團(tuán)的連接和一些熒光標(biāo)記闷游，尤其是當(dāng)熒光可能會(huì)因標(biāo)記太靠近DNA鏈而被淬滅時(shí)峻汉。 |
| 3'氨基修飾 | 目前提供3' C6 氨基修飾。它可用于設(shè)計(jì)新的診斷探針和反義核苷酸储藐，例如5'端可用高度敏感的32P或熒光素標(biāo)記的同時(shí)3'可用氨基修飾以進(jìn)行其他的連接俱济。此外嘶是，3'修飾可以抑制3'外切酶酶解钙勃，從而可用于反義實(shí)驗(yàn)。 |
| 巰基Thiol | 5'-巰基在很多方面與氨基修飾類似聂喇。巰基可用于加附各種修飾如熒光標(biāo)記物和生物素辖源。例如可以在碘乙酸和馬來(lái)酰亞胺衍生物存在下來(lái)制作巰基連接的熒光探針。5'的巰基修飾主要用5'巰基修飾單體（5'-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite 或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite）希太。用5'-Thiol-Modifier C6-CE單體修飾后必須進(jìn)行硝酸銀氧化以去除保護(hù)基（trityl）克饶，而Thiol-Modifier C6 S-S CE單體修飾后須用DTT將二硫鍵還原成巰基。 |
| 間臂 Spacer | Spacer 可為寡核苷酸標(biāo)記提供必要的間隔以減少標(biāo)記基團(tuán)與寡核苷酸間的相互作用誊辉，主要應(yīng)用于DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)和雙鏈結(jié)構(gòu)研究矾湃。C3 spacer 主要用于模仿核糖的3'和5'羥基間的三碳間隔，或"替代"一個(gè)序列中未知的堿基堕澄。3'-Spacer C3用于引進(jìn)一個(gè)3'間臂從而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶發(fā)揮作用邀跃。 Spacer 18 常用于引進(jìn)一個(gè)強(qiáng)親水基團(tuán)霉咨。 |
| 硫代Phosphorthioate | 硫代修飾的寡核苷酸主要用于反義實(shí)驗(yàn)中防止被核酸酶降解。您可以選擇全硫代拍屑，但隨著硫代堿基的增加途戒，寡核苷酸的Tm值會(huì)降低，為了降低這種這種影響僵驰，可以對(duì)引物兩端2-5個(gè)堿基進(jìn)行硫代修飾喷斋，通常可以選擇5'和3'各3個(gè)堿基進(jìn)行硫代修飾蒜茴。 |
| 脫氧脲嘧啶DeoxyUridine星爪，dU | 脫氧脲嘧啶可以插進(jìn)寡核苷酸來(lái)增加雙鏈的熔點(diǎn)溫度從而增長(zhǎng)雙鏈的穩(wěn)定性。每個(gè)脫氧胸腺嘧啶被脫氧脲嘧啶替代可以增長(zhǎng)雙鏈熔點(diǎn)溫度1.7 ℃粉私。 |
| 脫氧次黃嘌呤 deoxyInosine移必，dI | 脫氧次黃嘌呤是一個(gè)自然存在的堿基，雖然不是真正意義上的通用堿基毡鉴，但當(dāng)與其它堿基結(jié)合時(shí)崔泵，會(huì)比其它堿基錯(cuò)配相對(duì)更穩(wěn)定。脫氧次黃嘌呤與其它堿基的結(jié)合能力為dI:dC > dI:dA > dI:dG > dI:dT. 在DNA聚合酶的催化下猪瞬，脫氧次黃嘌呤首選與dC結(jié)合憎瘸。 |
4.如何保存引物？
引物合成后陈瘦，經(jīng)過(guò)一系列處理和純化步驟幌甘，旋轉(zhuǎn)干燥而成片狀物質(zhì)。沒(méi)有溶解的引物非常穩(wěn)定痊项，-20 ℃下可保存2-3年锅风，甚至更長(zhǎng)。溶解后的引物-20 ℃下避免反復(fù)凍融鞍泉，可以保存至少半年以上皱埠。如果對(duì)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性要求較高，合成的OD值較大咖驮，建議將溶解好的引物事先稀釋為100 μmol/L的儲(chǔ)存液边器，分裝數(shù)份保存于-20 ℃冰箱。使用前托修，將濃溶液稀釋成工作液（10 pmol/μl或20 pmol/μl）后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)忘巧。修飾熒光引物需要避光保存。
5.引物在常溫下運(yùn)輸睦刃，會(huì)降解嗎砚嘴？
不會(huì)降解，干燥的引物在常溫至少可以穩(wěn)定存放二周以上。而一般的運(yùn)輸時(shí)間通常都在1-3天际长，所以您收到的引物不會(huì)降解婆誓。
6.如何溶解引物？
干燥后的引物質(zhì)地非常疏松也颤，開(kāi)啟瓶蓋溶解之前最好在3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘 的轉(zhuǎn)速下離心1分鐘洋幻，或管垂直向上在桌面上輕敲幾次，將引物粉末收集到管底翅娶，防止開(kāi)蓋時(shí)引物散失文留。根據(jù)計(jì)算出的體積加入去離子無(wú)菌水或10 mM Tris pH 7.5緩沖液，室溫放置幾分鐘竭沫，上下混勻振蕩燥翅，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水蜕提，因?yàn)橛行┱麴s水的pH值比較低（pH 4-5）森书，引物在這種條件下不穩(wěn)定。
7已經(jīng)溶解的引物谎势，為什么原先使用正常凛膏，而過(guò)一段時(shí)間再使用就不好了？
如果溶解引物的水PH過(guò)低或污染了菌或核酸酶脏榆，會(huì)使引物降解猖毫。使用時(shí)沒(méi)有充分解凍混合，液體不均勻也可能會(huì)造成引物加入量不準(zhǔn)確须喂。建議分裝引物吁断，避免反復(fù)凍融，并使用10 mM Tris pH 7.5緩沖液溶解引物坞生。
8.TaqMan 探針設(shè)計(jì)的基本原則是什么仔役？
- TaqMan 探針位置盡可能靠近擴(kuò)增引物（擴(kuò)增產(chǎn)物50-150 bp），但不能與引物重疊是己。
- 長(zhǎng)度一般為18-40 mer 又兵。
- G-C含量控制在40-80%左右。
- 避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)赃泡，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)寒波。
- 在引物的5'端避免使用G。
- 選用比較多的堿基C升熊。
- 退火溫度Tm控制在 68-70 ℃左右
9.合成的熒光標(biāo)記探針應(yīng)如何保存?
- 熒光探針必須避光保存。
- 干品可于-80℃保存一年以上,如無(wú)條件绸栅，請(qǐng)于-20℃保存级野。
- 強(qiáng)烈建議用RNase-free的TE (pH 8.0) buffer溶解探針，這樣得到的探針溶液更穩(wěn)定，保存時(shí)間更長(zhǎng)蓖柔。通常辰企，將探針配制成100 pmol/μl的儲(chǔ)備液，分裝成幾份 (每份最多反復(fù)凍融5次)况鸣，于-20 ℃保存牢贸。使用前，將配制好的儲(chǔ)備液稀釋成工作液 (10 pmol/μl或20 pmol/μl)镐捧，剩余部分于-20 ℃保存潜索。
